TSG-6慢病毒表達(dá)及干擾載體的構(gòu)建及其對(duì)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、背景：組織損傷后的瘢痕形成等纖維化病理過(guò)程可歸因于炎癥反應(yīng)，其病變程度也與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。腫瘤壞死因子α刺激基因-6(tumor necrosis factorαstimulated gene6，TSG-6)已被證實(shí)具有抗炎作用，同時(shí)，在早期創(chuàng)面局部注射TSG-6蛋白可明顯抑制瘢痕的形成。故TSG-6基因及其表達(dá)或可與瘢痕的形成過(guò)程相關(guān)，但TSG-6蛋白參與瘢痕形成的機(jī)制尚不明確。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)分離培養(yǎng)人源瘢痕疙瘩成

2、纖維細(xì)胞并構(gòu)建人 TSG-6重組慢病毒表達(dá)載體與干擾載體，以此建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 TSG-6過(guò)表達(dá)及干擾表達(dá)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞株，觀察 TSG-6表達(dá)水平對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖效應(yīng)與凋亡效應(yīng)的影響，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法：采用酶消化法分離提取并純化培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞(human keloid fibroblast， HKF)，再以免疫組織化學(xué)法鑒定。構(gòu)建 pLVX-puro-TSG-6及pLVX-shRNA

3、1-TSG-6重組慢病毒載體，感染HKF細(xì)胞后，以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)與蛋白印跡檢測(cè)(Western blot，WB)檢驗(yàn)各組細(xì)胞TSG-6基因在mRNA水平及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況。后以 MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間段內(nèi)各組細(xì)胞的增殖與凋亡情況，并分別以PCR及WB檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2、P53及Active-ca

4、spase-3的表達(dá)。
　　結(jié)果：與結(jié)論成功分離原代人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞多呈梭形，傳至五代后行波形蛋白的免疫組織化學(xué)染色，陽(yáng)性率為100％，細(xì)胞角蛋白染色陰性。重組慢病毒載體及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建成功，細(xì)胞中 TSG-6的表達(dá)發(fā)生明顯變化。與對(duì)照組相比，TSG-6過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖減緩，凋亡率顯著升高，TSG-6干擾組細(xì)胞增殖加快，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。Western blot結(jié)果提示，TSG-6過(guò)表達(dá)組B