UPLC-MS-MS檢測人體生物樣本Etheno-DNA加合物的方法研究.pdf

1、DNA作為細胞生命活動最重要的遺傳物質(zhì),保持其分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和完整性對于細胞活性和生理功能的正常發(fā)揮具有重要意義。DNA氧化損傷主要是活性氧自由基及其代謝產(chǎn)物攻擊DNA,并與DNA堿基結(jié)合形成加合物引起的。DNA是內(nèi)源性及外源性如輻射和化學(xué)氧化劑誘導(dǎo)引起的活性氧自由基進攻細胞的主要目標,DNA加合物可以作為生物標志物來反映化學(xué)致癌物到達靶位的內(nèi)接觸劑量,也可以作為一種效應(yīng)標志物,反映DNA受到化學(xué)致癌物損傷的效應(yīng)劑量。因此,建立高靈敏

2、度、高特異性的DNA加合物檢測方法是毒理學(xué)研究的熱點之一。
　　 本文利用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜,建立了人群生物樣本(血、尿)中1,N6-ethcno-2-deoxyadcnosine(εdA)和3,N4-etheno-2'-dcoxycytidine(εdC)加合物的檢測方法,該方法利用同位素標記的[15N5]εdA和[15N3]εdC作為內(nèi)標,具有高靈敏度、高特異性和高通量的特點,適用于大量樣本的人群生物監(jiān)測和分

3、子流行病學(xué)研究。研究內(nèi)容主要包括以下三個方面:
　　 1.標準品的合成、純化和定量:包括合成3,N4-etheno-2'-deoxycytidine(εdC)加合物作為外標,穩(wěn)定同位素標記的[15N5]1,N6-etheno-2'-deoxyadcnosine和[15N3]3,N44-ethcno-2'-deoxycytidine加合物作為內(nèi)標。采用RP-HPLC進行純化、脫鹽,對純化后的標準品進行定量。合成的標準品作為內(nèi)標和外

4、標用于計算生物樣本中εdA和εdC加合物的量,校正生物樣本前處理過程εdA和εdC加合物的回收率。
　　 2.生物樣本(血、尿)的前處理方法的建立和優(yōu)化:DNA加合物在人體生物樣本中含量很低(通常108個堿基中0.1-1個加合物)。建立高特異性、高靈敏度的DNA加合物的檢測方法,關(guān)鍵在于生物樣本前處理方法的優(yōu)化。本研究采用micrococcal endonuclcase,spleen phosphodiesterase,nucl

5、ease P1酶解結(jié)合RP-HPLC的方法。富集和純化血中εdA和εdC加合物;采用固相萃取富集和純化尿中的εdA和εdC加合物。該方法具有簡便易行、回收率高的特點,尿中εdA和εdC回收率分別為:89.6±6.52％和88.9±7.7%;血中εdA和εdC回收率分別為:83.7±7.1%和83.3±2.9%。
　　 3.建立和優(yōu)化UPLC-MS/MS的條件,檢測生物樣本中etheno-DNA加合物:采用ESI正離子模式和多反應(yīng)