大鼠體外肝微粒體中CYP1A2和CYP2C9的活性測定及兩種中藥注射液對其影響的研究.pdf

1、目的:建立大鼠體外肝微粒體孵育體系，分別以非那西丁和雙氯芬酸作為CYP1A2和CYP2C9的特異性探針?biāo)幬?，通過高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分別測定大鼠肝微粒體體系中探針?biāo)幬锓悄俏鞫『碗p氯芬酸的代謝產(chǎn)物對乙酰氨基酚和4-羥基雙氯芬酸的濃度，計算肝微粒體中非那西丁和雙氯芬酸的酶動力學(xué)參數(shù)，進(jìn)而評價兩種酶的活性。同時將不同體積百分濃度的腎康注射液和丹紅注射液加入到

2、孵育體系中，通過測定對乙酰氨基酚和4-羥基雙氯芬酸的生成量，計算半數(shù)抑制濃度IC50來評價兩種中藥注射液在體外對CYP1A2和CYP2C9酶活性影響。
　　 方法:建立體外肝微粒體孵育體系，優(yōu)化色譜條件，測定對乙酰氨基酚色譜條件為采用Hypersil BDS C18柱(150 mm×4.6mm，5μm)，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測波長245 nm。流動相A為乙腈，B為50.0 mmol·L-1磷酸氫二鈉緩

3、沖液(pH4.5)，梯度洗脫;測定4-羥基雙氯芬酸色譜條件為采用Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流速為0.8 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測波長276 nm。流動相A為乙腈，B為50.0 mmol·L-1磷酸氫二鈉緩沖液(pH4.5)，等度洗脫。分別優(yōu)化肝微粒體體系的孵育時間、蛋白濃度，將探針?biāo)幬锓悄俏鞫『碗p氯芬酸分別加入體系中，通過HPLC測定代謝產(chǎn)物對乙酰氨基酚和4-羥基雙氯芬酸的濃度

4、，以Lineweaver— Burk作圖計算Vmax與Km值。并將不同體積百分濃度的腎康和丹紅注射液加入到微粒體孵育體系中，通過測定對乙酰氨基酚和4-羥基雙氯芬酸的生成量，分別計算出腎康和丹紅注射液對CYP1A2和CYP2C9的半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　 結(jié)果:經(jīng)過優(yōu)化孵育條件，并且經(jīng)陽性抑制劑的驗證，建立的肝微粒體孵育體系符合要求。在優(yōu)化的色譜條件下，非那西丁與雙氯芬酸及其各自內(nèi)標(biāo)和代謝產(chǎn)物對乙酰氨基酚和4-羥基雙氯芬酸

5、峰形良好，且酶反應(yīng)體系中無其他內(nèi)源性物質(zhì)干擾。對乙酰氨基酚線性范圍0.300～20.0μmol/L。日內(nèi)、日間精密度均小于10％，準(zhǔn)確度在85％～115％范圍內(nèi)，處理回收率大于85％，穩(wěn)定性均小于10％;4-羥基雙氯芬酸線性范圍0.500～30.0μmol/L。日內(nèi)、日間精密度均小于10％，準(zhǔn)確度在85％～115％范圍內(nèi)，處理回收率大于85％，穩(wěn)定性均小于10％。對乙酰氨基酚的酶動力學(xué)參數(shù)Vmax為Km為100.5μmol·L-1，1.

6、06 nmol·min-1·mg protein-1;4-羥基雙氯芬酸的酶動力學(xué)參數(shù)Km為17.1μmol·L-1，Vmax為1.25 nmol·min-1·mg protein-1，。腎康注射液對CYP1A2和CYP2C9的IC50分別為7.8％和5.9％。丹紅注射液對CYP1A2無明顯抑制作用，對CYP2C9的IC50為1.1％。
　　 結(jié)論:本文建立的HPLC法測定大鼠體外肝微粒體孵育體系中CYP1A2和CYP2C9酶活性