大鼠體外肝微粒體中CYP1A2和CYP2C9的活性測(cè)定及兩種中藥注射液對(duì)其影響的研究.pdf

1、目的:建立大鼠體外肝微粒體孵育體系，分別以非那西丁和雙氯芬酸作為CYP1A2和CYP2C9的特異性探針?biāo)幬?，通過(guò)高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分別測(cè)定大鼠肝微粒體體系中探針?biāo)幬锓悄俏鞫『碗p氯芬酸的代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚和4-羥基雙氯芬酸的濃度，計(jì)算肝微粒體中非那西丁和雙氯芬酸的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)，進(jìn)而評(píng)價(jià)兩種酶的活性。同時(shí)將不同體積百分濃度的腎康注射液和丹紅注射液加入到

2、孵育體系中，通過(guò)測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚和4-羥基雙氯芬酸的生成量，計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50來(lái)評(píng)價(jià)兩種中藥注射液在體外對(duì)CYP1A2和CYP2C9酶活性影響。
　　 方法:建立體外肝微粒體孵育體系，優(yōu)化色譜條件，測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚色譜條件為采用Hypersil BDS C18柱(150 mm×4.6mm，5μm)，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm。流動(dòng)相A為乙腈，B為50.0 mmol·L-1磷酸氫二鈉緩

3、沖液(pH4.5)，梯度洗脫;測(cè)定4-羥基雙氯芬酸色譜條件為采用Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流速為0.8 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm。流動(dòng)相A為乙腈，B為50.0 mmol·L-1磷酸氫二鈉緩沖液(pH4.5)，等度洗脫。分別優(yōu)化肝微粒體體系的孵育時(shí)間、蛋白濃度，將探針?biāo)幬锓悄俏鞫『碗p氯芬酸分別加入體系中，通過(guò)HPLC測(cè)定代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚和4-羥基雙氯芬酸的濃度

4、，以L(fǎng)ineweaver— Burk作圖計(jì)算Vmax與Km值。并將不同體積百分濃度的腎康和丹紅注射液加入到微粒體孵育體系中，通過(guò)測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚和4-羥基雙氯芬酸的生成量，分別計(jì)算出腎康和丹紅注射液對(duì)CYP1A2和CYP2C9的半數(shù)抑制濃度(IC50)。
　　 結(jié)果:經(jīng)過(guò)優(yōu)化孵育條件，并且經(jīng)陽(yáng)性抑制劑的驗(yàn)證，建立的肝微粒體孵育體系符合要求。在優(yōu)化的色譜條件下，非那西丁與雙氯芬酸及其各自?xún)?nèi)標(biāo)和代謝產(chǎn)物對(duì)乙酰氨基酚和4-羥基雙氯芬酸

5、峰形良好，且酶反應(yīng)體系中無(wú)其他內(nèi)源性物質(zhì)干擾。對(duì)乙酰氨基酚線(xiàn)性范圍0.300～20.0μmol/L。日內(nèi)、日間精密度均小于10％，準(zhǔn)確度在85％～115％范圍內(nèi)，處理回收率大于85％，穩(wěn)定性均小于10％;4-羥基雙氯芬酸線(xiàn)性范圍0.500～30.0μmol/L。日內(nèi)、日間精密度均小于10％，準(zhǔn)確度在85％～115％范圍內(nèi)，處理回收率大于85％，穩(wěn)定性均小于10％。對(duì)乙酰氨基酚的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax為Km為100.5μmol·L-1，1.

6、06 nmol·min-1·mg protein-1;4-羥基雙氯芬酸的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為17.1μmol·L-1，Vmax為1.25 nmol·min-1·mg protein-1，。腎康注射液對(duì)CYP1A2和CYP2C9的IC50分別為7.8％和5.9％。丹紅注射液對(duì)CYP1A2無(wú)明顯抑制作用，對(duì)CYP2C9的IC50為1.1％。
　　 結(jié)論:本文建立的HPLC法測(cè)定大鼠體外肝微粒體孵育體系中CYP1A2和CYP2C9酶活性