花粉介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)花青素基因NtAN2的研究及大蒜半胱氨酸合成酶性質(zhì)的研究.pdf

1、利用超聲波輔助花粉介導(dǎo)法將花青素基因NtAn2導(dǎo)入玉米自交系鄭58。優(yōu)化超聲波輔助花粉介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化方法的遺傳轉(zhuǎn)化體系。以新鮮的鄭58玉米花粉為試驗(yàn)材料，檢測其在不同濃度的蔗糖溶液中的體外萌發(fā)率;通過正交設(shè)計(jì)方法，對超聲波處理功率、處理時間、處理次數(shù)3個因素進(jìn)行優(yōu)化;通過正交試驗(yàn)對農(nóng)桿菌菌液濃度、超聲波處理參數(shù)、蔗糖用液濃度、AS濃度四個因素進(jìn)行優(yōu)化確定最有效的轉(zhuǎn)化組合。然后將NtAN2通過花粉介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化至玉米自交系鄭58中。對收獲的籽粒

2、的植株后代進(jìn)行PCR檢測、Dot blot雜交分析、southern blot雜交分析以及轉(zhuǎn)基因植株花青素含量的測定比較與分析。結(jié)果表明：玉米自交系鄭58的花粉最適宜的蔗糖溶液濃度為20％;超聲波處理最佳參數(shù)為:處理功率為150w,處理時間為5s/次，處理次數(shù)為6次。綜合考慮轉(zhuǎn)化效率和結(jié)實(shí)效率轉(zhuǎn)化中農(nóng)桿菌菌液最適濃度OD600為0.6、AS最適濃度為100μmol/L、蔗糖溶液最適濃度為20％、超聲波處理參數(shù)為處理功率為150w,處理時

3、間為5s/次，處理次數(shù)為6次。收獲的籽粒中兩粒呈紫色，經(jīng)過PCR、southern鑒定成陽性，初步證實(shí)NtAN2已被整合到玉米基因組中，并且可以被用于對轉(zhuǎn)化子的直觀篩選。隨后對其T2代植株進(jìn)行檢測的結(jié)果也均成陽性，證實(shí)外源基因可以穩(wěn)定的遺傳本研究確立了超聲波輔助花粉介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化的最佳體系，為提高該植物基因轉(zhuǎn)化方法的效率奠定了基礎(chǔ)。
　　大蒜是一種現(xiàn)食藥兩用的植物，備受關(guān)注，它在植物、動物、人類醫(yī)學(xué)界都有重要地位，尤其是它在植物中

4、的抑菌作用，本研究利用這一性質(zhì)探究它對玉米病菌的抑菌效果如何，并且有研究表明半胱氨酸合成酶的產(chǎn)物半胱氨酸是大蒜中含硫氨基酸豐富是植物中含硫氨基酸的重要來源，研究大蒜半胱氨酸合成酶的性質(zhì)及生物學(xué)功能以明確其在大蒜硫代謝中的作用。利用涂布打孔發(fā)法比較分析大蒜粗酶提取液、大蒜素、蒜氨酸酶對玉米的霉菌、絲黑穗菌、黑粉病菌的抑制情況。利用生物信息學(xué)技術(shù)分析從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的3個大蒜的半胱氨酸合成酶基因（ASGCS2、ASGCS3和ASGCS

5、4）的開放閱讀框，預(yù)測其蛋白序列、分子量大小、蛋白質(zhì)特性、亞細(xì)胞定位、系統(tǒng)進(jìn)化等特征;通過熒光定量PCR分析了3個半胱氨酸合成酶的組織表達(dá)特性。結(jié)果表明：大蒜素及粗酶提取液對玉米的三種病菌都以抑制作用。3個大蒜的半胱氨酸合成酶基因ASGCS2、ASGCS3和ASGCS4的開放態(tài)讀碼框長度分別為1152bp，1296bp和1236bp;其編碼蛋白的理論相對分子量分別為40.6KD，34.1KD和36.1KD。ASGCS2被亞細(xì)胞定位于葉綠

6、體中，而ASGCS3和ASGCS4均被定位于細(xì)胞質(zhì)中。氨基酸比對結(jié)果表明，ASGCS2與ASGCS3相似度為70％，與ASGCS4相似度為59％;而ASGCS3與ASGCS4相似度為68％。進(jìn)化分析表明，AsGCS2屬于Bsas2亞家族，AsGCS3屬于Bsas1亞家族，AsGCS4屬于Bsas6亞家族。熒光定量PCR結(jié)果表明，大蒜不同CSase的組織特異性是不同的，ASGCS2在葉中表達(dá)量最高，ASGCS3在根中表達(dá)量最高，而ASGC