人支氣管上皮細胞γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞單位基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的實驗研究.pdf

1、背景: 肺及支氣管組織易受到來源于體內(nèi)外各種氧化因素的作用而形成損害，發(fā)展成炎癥性疾病或腫瘤。谷胱甘肽(GSH)是肺組織內(nèi)抗氧化機制中的最重要因素之一。多種刺激可在不同水平調(diào)節(jié)肺組織細胞內(nèi)外的GSH濃度，其中一個重要的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)是轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控GSH合成的限速酶—γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外GSH濃度，促進肺及支氣管組織損傷修復或保護肺組織免受氧化損害。對γ-GCS特別是催化亞單位(GCLC)合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)

2、控進行研究有助于在分子生物學水平了解GSH變化的機制。 目的: 對人γ-GCS催化亞單位(GCLC)基因調(diào)控區(qū)進行研究，以期發(fā)現(xiàn)對GCLC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要作用的基因調(diào)控元件及其相關的轉(zhuǎn)錄因子，明確GCLC基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，從而部分闡明GCLC及GSH在細胞內(nèi)外的變化機制，為在分子生物學水平闡明肺疾病機制提供一定的理論基礎，并最終為治療肺疾病找到合適的干預措施。 方法: 一．克隆人GCLC基因調(diào)控區(qū)的

3、基因片段：(一)以GenBank公布的人GCLC基因的核苷酸序列(GI：4902626)為模板設計并合成PCR引物。(二)以高保真DNA聚合酶應用PCR方法從人支氣管上皮細胞系16HBE中提取的基因組DNA中克隆基因轉(zhuǎn)錄起始位點位置-3490—+523 bp、+3490—+451 bp、-3490—+131bp、-2744—+81bp的目的基因片段，并進行T-A克隆，送測序公司測序。(三)將成功克隆的目的基因片段亞克隆至含增強子而無啟動

4、子的能表達蟲熒光素酶報告基因的PGL-3載體中，構建野生型表達質(zhì)粒。 二．基因突變：(一)構建能表達蟲熒光素酶基因的系列嵌套缺失突變體質(zhì)粒：1．對能表達蟲熒光素酶基因的野生型質(zhì)粒PL28應用限制性內(nèi)切酶Mlu I及Sac I進行雙酶切，使其線性化。按意義鏈的DNA順序，經(jīng)內(nèi)切酶修飾的線性DNA片段的5`端、3`端均為含四個堿端突出的粘性末端，而反意義鏈的3`端為四個堿基的凹端。2．核酸外切酶Ⅲ及S1核酸酶體系作用已線性化的質(zhì)粒P

5、L28基因片段。3．通過限制性內(nèi)切酶進行酶切鑒定及測序篩選鑒定有效的序列缺失體表達質(zhì)粒。(二)應用重疊延伸PCR方法對GCLC基因調(diào)控區(qū)的ARE調(diào)控元件、E-box調(diào)控元件及NF-κB調(diào)控元件進行缺失突變，將突變的基因片段進行T-A克隆，送測序公司測序鑒定。成功突變ARE調(diào)控元件、E-box調(diào)控元件及NF-κB調(diào)控元件的基因片段亞克隆至已構建成功的能表達蟲熒光素酶報告基因的野生型質(zhì)粒中，替代含有上述調(diào)控元件的基因片段，構建表達蟲熒光素酶

6、報告基因的缺失突變型質(zhì)粒。 三．基因調(diào)控功能研究：將野生型表達質(zhì)粒、突變型表達質(zhì)粒與內(nèi)參照質(zhì)粒pSV-β-gal共轉(zhuǎn)染人支氣管上皮細胞系16HBE，檢測基因轉(zhuǎn)染后表達β-gal和蟲熒光素酶活性的量值，以質(zhì)粒表達的蟲熒光素酶相對活性值揭示基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。 四．基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及轉(zhuǎn)錄因子的鑒定：采用地戈辛標記的雙鏈寡核苷酸作為陽性探針，未標記的含AP-2、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子結合序列的雙鏈寡核苷酸作為競爭性探針與核蛋白提取物

7、進行電泳遷移率變動性分析(EMSA)；以結合人AP-2、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的抗體進行超泳動分析(super-shift)。 結果: 一．成功克隆出人GCLC基因調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始位點位置-3490—+523 bp、-3490—+451 bp、-3490—+131bp、-2744—+81bp區(qū)間的目的基因片段，構建表達蟲熒光素酶基因的表達質(zhì)粒PL91、PL45、PL34、PL28。 二．成功構建出表達蟲熒光素酶基因的

8、系列缺失突變體質(zhì)粒，其名稱及相對基因轉(zhuǎn)錄起始位點位置如下表。 三．成功構建出缺失突變ARE調(diào)控元件、E-box調(diào)控元件及NF-B調(diào)控元件的表達蟲熒光素酶基因的突變體表達質(zhì)粒PLdel-ARE、PLdel-E-Box、PLA4及PLA5。 四．野生型質(zhì)粒PL91無基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，可作為陰性對照質(zhì)粒；野生型質(zhì)粒PL45、PL34、PL28質(zhì)粒的基因調(diào)控片段的基因調(diào)控功能無差別，轉(zhuǎn)錄起始位點下游+81bp以遠的3`UTR區(qū)對

9、基因轉(zhuǎn)錄影響不明顯。 五．人GCLC基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游-810—769bp區(qū)間存在負性調(diào)控區(qū)；在-864—838bp、-769—538bp、-421—341bp區(qū)間存在正性調(diào)控區(qū)。 六．人GCLC基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游-810—769bp區(qū)間的-784—770區(qū)域為AP-2轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件部位，其與轉(zhuǎn)錄因子AP-2相互作用后起重要的負性轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。 七．人GCLC基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游-810—769bp區(qū)間的-79

10、0—785區(qū)域為具有正性調(diào)控作用，定點缺失后GCLC基因轉(zhuǎn)錄功能明顯下降；該區(qū)域為一個NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。 八．轉(zhuǎn)錄因子AP-2能抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB對人GCLC基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游-790—766DNA序列的結合。 九．突變體質(zhì)粒PLdel-ARE、PLdel-E-Box表達功能明顯上升表明：ARE、E-Box調(diào)控元件具有負轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。 結論: 一．人GCLC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)近端存在多個正性及負性

11、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)：在基因調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點上游-864—838bp、-769—538bp、-421—341bp區(qū)間存在正性調(diào)控區(qū)；GCLC基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游-810—769bp區(qū)間存在負性調(diào)控區(qū)，其重要的負性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件是AP-2，作用的轉(zhuǎn)錄因子為AP-2。 二．人GCLC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)-790—785為正性調(diào)控區(qū)，為轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件NF-кB所在位置，其作用的轉(zhuǎn)錄因子為NF-кB。轉(zhuǎn)錄因子AP-2可抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-кB與-790

12、—766 DNA序列結合。 三．人GCLC基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)遠端存在兩個負性調(diào)控元件：1 ARE轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件位于人類GCLC基因調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點上游-3148—3138bp區(qū)，其DNA系列與AP-1調(diào)控元件重疊。2 E-box調(diào)控元件位于人類GCLC基因調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄起始位點上游-3100—3087bp區(qū)。 四．本實驗研究克隆構建了多個以GCLC基因調(diào)控區(qū)啟動和調(diào)控的表達蟲熒光素酶報告基因的野生型質(zhì)粒及相應的突變型質(zhì)粒。為今后