CD36介導(dǎo)的腎臟AA淀粉樣變的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　腎臟AA淀粉樣變性（amyloidosis）是由多種慢性疾病狀態(tài)所致的，突出特點(diǎn)是淀粉樣物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外沉積，通過(guò)各種途徑誘導(dǎo)腎臟組織結(jié)構(gòu)與功能異常。患者主要表現(xiàn)為腎病綜合征，隨病情進(jìn)展晚期表現(xiàn)為明顯腎衰竭癥狀，最終導(dǎo)致死亡。通過(guò)更好地控制炎癥能明顯改善其預(yù)后，但目前這個(gè)疾病的發(fā)病機(jī)制是不清楚的，更缺乏有效的治療。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶（CD36）屬于B族清道夫受體，是連接機(jī)體脂代謝和炎癥的重要膜蛋白，被認(rèn)為是治療代謝性疾病的重要

2、靶點(diǎn)。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)CD36參與了血清淀粉樣蛋白A（SAA）的攝取及SAA誘導(dǎo)的炎性因子的分泌過(guò)程。本研究旨在探討CD36是否參與了腎臟AA淀粉樣變所致的腎臟損害及其作用機(jī)制。
　　方法：
　　第一部分：選取8周齡野生型（wild type,WT）小鼠，隨機(jī)分為兩組，0.5ml10%酪蛋白(Casein)隔日皮下注射為實(shí)驗(yàn)組（Casein組），對(duì)照組（Control組）給予等量生理鹽水隔日皮下注射。按上述處理15周后先常規(guī)

3、收集小鼠24h尿液，再采集眶靜脈血離心取血清，最后分離腎臟組織。SAA濃度檢測(cè)采用了酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒。小鼠腎臟淀粉樣變模型的確認(rèn)采用了剛果紅染色；實(shí)驗(yàn)小鼠腎臟組織CD36的表達(dá)同時(shí)采用了免疫印跡（Western blot）和免疫組化兩種方法檢測(cè)。
　　第二部分：選取8周齡野生型（WT）小鼠和CD36-/-小鼠隨機(jī)分為三組，0.5ml10%酪蛋白(

4、Casein)隔日皮下注射為實(shí)驗(yàn)組WT Casein（+）和CD36-/-Casein（+）,對(duì)照組WT Casein（-）給予等量生理鹽水隔日皮下注射。15周常規(guī)后收集小鼠尿液、血清液及腎臟組織。檢測(cè)小鼠的血尿生化指標(biāo)。剛果紅及高錳酸鉀處理后剛果紅染色觀察小鼠腎臟淀粉樣變及類(lèi)型；透射電鏡（transmission electron microscope,TEM）、蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin and Eeosinstain

5、ing,H&E）和MASSON染色觀察腎臟病理改變，Western blot、Q-PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）檢測(cè)腎臟損害的炎癥及纖維化基因的mRNA和蛋白表達(dá)。
　　第三部分：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選用第二部分的WT Casein(+)和CD36-/-Casein(+)兩個(gè)組的動(dòng)物模型作為體內(nèi)模型；電鏡觀察小鼠腎臟組織自噬體數(shù)量，Western blot、Q-PCR檢測(cè)LC3的表達(dá)。

6、免疫熒光檢測(cè)腎臟組織的LC3和AA表達(dá)及兩者的共定位關(guān)系。采用Western blot法和免疫組化法檢測(cè)AMPK，P-AMPK的表達(dá)。CHIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了CD36與LC3的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)相關(guān)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選取腎臟的常用的兩種細(xì)胞系，即人腎臟系膜細(xì)胞（Human mesangial cells,HMCs）和人近曲小管上皮細(xì)胞（Human proximal tubular cell,HK2）。選用了小干擾RNA（small interferi

7、ng RNA,siRNA）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染建立了CD36 siRNA HMCs和HK2細(xì)胞的體外模型。進(jìn)一步的用SAA1ug/ml處理CD36干擾的兩種不同的細(xì)胞建立體外細(xì)胞AA淀粉樣變模型。在SAA處理狀態(tài)下，用自噬檢測(cè)試劑盒觀察干擾CD36對(duì)腎臟細(xì)胞自噬的影響。用自噬抑制劑wortman(200nmol/L）處理HK2細(xì)胞和HMCs細(xì)胞后分別分成4組：陰性對(duì)照組（NCi+SAA），CD36干擾對(duì)照組（CD36i+SAA）,實(shí)驗(yàn)對(duì)照+自噬抑制

8、劑組（NCi+SAA+wortman），CD36干擾對(duì)照+自噬抑制劑組（CD36i+SAA+wortman）。免疫熒光檢測(cè)HK2細(xì)胞內(nèi)AA的沉積狀況。Q-PCR檢測(cè)HK2細(xì)胞和HMCs細(xì)胞的炎癥和纖維化基因表達(dá)情況。再用AMPK抑制劑Compound C(10umol/L)分別處理HK2和HMCs細(xì)胞，將其分為4組：陰性對(duì)照組（NCi+SAA）,CD36干擾對(duì)照組（CD36i+SAA），陰性對(duì)照+AMPK抑制劑組（NCi+SAA+Com

9、pound C)，CD36干擾對(duì)照+AMPK抑制劑組（CD36i+SAA+Compound C）。用自噬檢測(cè)試劑盒檢測(cè)自噬，用Q-PCR檢測(cè)LC3的表達(dá)。以自噬強(qiáng)度和LC3的表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)抑制AMPK活性對(duì)SAA作用下HK2和HMCs的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分：Casein皮下注射能上調(diào)WT小鼠血清中血清淀粉樣蛋白A（serum amyloidA，SAA)的含量。剛果紅染色和電鏡結(jié)果顯示Casein能夠誘導(dǎo)WT小鼠腎臟發(fā)

10、生淀粉樣變；免疫組化和Western blot結(jié)果均顯示在Casein誘導(dǎo)的淀粉樣變小鼠中CD36的表達(dá)是上調(diào)的。
　　第二部分：剛果紅染色在光鏡和偏振光下觀察到CD36缺失能改善Casein誘導(dǎo)的小鼠腎臟淀粉樣變；而高錳酸鉀處理后的剛果紅染色三組均為陰性，說(shuō)明了在本實(shí)驗(yàn)中Casein所誘導(dǎo)的腎臟淀粉樣變是AA型的淀粉樣變。另外我們的透射電鏡結(jié)果也可看到WT Casein(+)組小鼠腎臟有明顯的淀粉樣纖維沉積，而CD36-/-Ca

11、sein（+）組和WT Casein(-)組沒(méi)有觀察到。血尿檢測(cè)顯示W(wǎng)T Casein（+）組小鼠表現(xiàn)出明顯的腎病綜合征癥狀，即尿量增多，大量蛋白尿，明顯的低蛋白血癥和高脂血癥等，而CD36-/-Casein（+）組小鼠腎功能有改善。H&E、MASSON染色、Western blot和Q-PCR結(jié)果均顯示CD36-/-Casein(+)組小鼠腎臟纖維化和炎癥水平較WT Casein(+)組明顯減輕。
　　第三部分：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；TEM

12、觀察到CD36-/- Casein(+)組腎小管區(qū)自噬小體較WT Casein(+)增多；CD36-/-Casein(+)組腎臟組織的AA沉積減少而LC3的表達(dá)是上調(diào)的，且AA沉積的部位和LC3表達(dá)的部位能夠重疊。WT Casein(+)組較CD36-/-Casein(+)組小鼠腎臟組織內(nèi)p-AMPK表達(dá)水平明顯降低，且CD36-/-Casein(+)組腎臟組織LC3的表達(dá)較WT Casein(+)增高。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：同時(shí)給與SAA處理后，

13、CD36i組較NCi組的自噬明顯增加，AA積聚減少，細(xì)胞炎癥和纖維化指標(biāo)表達(dá)下調(diào)的；自噬抑制劑wortman處理后,NCi組和RNAi組的上述指標(biāo)改變都無(wú)明顯差異。另外在AMPK抑制劑Compound C的處理下NCi組和RNAi組的自噬表達(dá)明顯下降，且兩組無(wú)顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1、Casein能誘導(dǎo) WT小鼠腎臟淀粉樣變的發(fā)生，同時(shí)伴有CD36蛋白的異常高表達(dá)。
　　2、CD36參與了Casein誘導(dǎo)的小鼠腎