輕鏈型淀粉樣變中輕鏈致心肌毒性的機制研究.pdf

1、目的：
　　輕鏈型淀粉樣變(AL)是一種腫瘤性漿細胞產(chǎn)生的輕鏈沉積在各個器官導致其功能不全的血液疾病。如無有效的治療，患者的生存期僅有1～2年。心臟受累程度是決定AL患者預后的重要因素。但是，AL中輕鏈致心肌毒性的機制還不清楚。另外，AL輕鏈(AL-LC)的來源受限也是困擾研究者們的一個重要問題，目前AL-LC的主要來源是從患者尿液中提取，存在獲取AL-LC總量有限及LC的異質(zhì)性等諸多問題，而從原核系統(tǒng)表達AL-LC則導致其翻譯后

2、修飾缺乏。因此，建立穩(wěn)定表達AL-LC的真核表達平臺也至關(guān)重要。
　　方法：
　　通過構(gòu)建pcDNA3.1重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入293T細胞體外表達IGLV1-44來源的AL心肌毒性輕鏈，建立AL輕鏈的真核系統(tǒng)表達平臺。將合成的AL輕鏈作用于心肌細胞，并設(shè)置多發(fā)性骨髓瘤輕鏈(MM-LC)對照及空白對照，研究輕鏈與H9C2心肌細胞的相互作用。首先，通過免疫熒光激光共聚焦定位檢測輕鏈與心肌細胞的定位關(guān)系。其次，用流式細胞術(shù)檢測心肌細胞的

3、凋亡率及活性氧自由基(ROS)水平。再次，用Western Blot分析心肌細胞蛋白表達水平的變化，探究AL輕鏈心肌毒性可能涉及的分子通路。
　　結(jié)果：
　　轉(zhuǎn)入pcDNA3.1重組質(zhì)粒的293T細胞穩(wěn)定合成表達AL輕鏈，AL輕鏈的真核系統(tǒng)表達平臺成功建立。AL與MM輕鏈均可進入心肌細胞，但AL輕鏈明顯多于MM輕鏈，且能在細胞外間質(zhì)形成沉積，包繞心肌細胞。然而，AL輕鏈與MM輕鏈均不與線粒體共定位。將體外合成的AL輕鏈作用于

4、心肌細胞引起細胞凋亡，使用濃度為40μg/ml、60μg/ml及80μg/ml的AL輕鏈作用心肌細胞24h后的凋亡率分別為10％、18％和26％，相比MM輕鏈對照及空白對照(～5％)明顯升高。利用DCFH-DA檢測心肌細胞ROS水平，60μg/ml AL輕鏈作用2h及4h后心肌細胞的MFI值分別為13018.39±338.37及16766.86±29.47，其中4h組顯著高于對照組水平（MM組:13191.70±409.04，空白對照1

5、2917.81±614.69）。同時，在作用6h或12h時，AL組的凋亡標志物c-casp3水平均可檢測到顯著升高。分子通路方面，AL輕鏈處理心肌細胞6h及12h后，p-p38MAPK水平較MM組及空白對照升高，且下游的PP2A水平在6h時明顯升高，12h時回到對照水平，但NF-κB、p-MEK1/2及JNK水平AL組與對照無明顯差別。另外，AL輕鏈可引起心肌細胞p-AMPK及下游FoxO3水平下降，但激活AMPK并不能逆轉(zhuǎn)心肌細胞的凋