JIP3介導TrkB受體順軸突轉運及增強BDNF引發(fā)的信號通路激活的功能研究.pdf

1、研究背景
　　 神經元作為一種高度極化的細胞，通常由胞體、一條軸突和若干條樹突組成，通過這些軸突和樹突來與周圍細胞發(fā)生聯(lián)系；因此各種蛋白分子在神經元突起中的精確定位對于神經元的功能是非常重要的。目前已知，蛋白分子在神經元軸突和樹突中的長距離順向轉運(由胞體向遠端)主要是由沿著微管運行的分子馬達kinesin介導的。其中，在神經元中起到多種功能的運載體的亞型是傳統(tǒng)型kinesin(kinesin-1)，它是由兩條重鏈(kinesi

2、n heavy chain，KHC)和兩條輕鏈(kinesin lightchain，KLC)組成。目前發(fā)現的能夠與kinesin-1結合的許多種可溶性的銜接蛋白通過與kinesin-1結合從而介導一些膜結合運載物來通過kinesin-1沿著微管運動。但是，目前尚不清楚在神經元當中哪些運載蛋白是通過kinesin-1來轉運的。
　　 神經營養(yǎng)因子(Neurotrophins，NTS)是一類對神經元的發(fā)育、存活和凋亡起重要作用的蛋

3、白質，其成員包括神經生長因子(NGF)，腦源性生長因子(BDNF)，神經營養(yǎng)因子3(NT-3)，神經營養(yǎng)因子4(NT-4)等，在神經元的存活、分化、神經突起的形成以及調節(jié)神經環(huán)路的功能中起到重要的作用。尤其是腦源性神經營養(yǎng)因子(brain derived neurophic factor，BDNF)在活性依賴的突觸功能的變化中起到極為關鍵的作用。靶組織中分泌的BDNF與位于神經元軸突末梢的TrkB受體結合后可激活受體進行逆向信號轉導。因

4、此，神經元中的TrkB受體在細胞體內正確的合成、轉運以及定位對于BDNF信號傳導至關重要。TrkB受體在神經細胞里沿著軸突和樹突順向轉運(從胞體向神經細胞末梢方向)需要由kinesin-1來介導。但是，TrkB受體在神經元軸突和樹突中轉運機制是否相同目前還尚不清楚。目前已有報道，TrkB受體在神經元中是由Rab27B/Slp1/CRMP-2這個銜接復合體介導與kinesin-1結合從而進行順向轉運的。但是，該實驗數據顯示，敲除掉這個銜接

5、復合體中的任何蛋白只能使到達軸突末梢的TrkB受體減少30-50％，說明TrkB受體在神經元中的順向轉運還存在有其他的機制。
　　 JNK相互作用蛋白3(JNK-interacting protein3；JIP3)在腦組織中廣泛表達，在神經元當中分布于樹突、核周體以及神經元軸突。JIP3最初作為一種JNK相互作用蛋白被發(fā)現，并且以支架蛋白的方式引發(fā)特異的氨基末端激酶信號分子。后續(xù)的基因學研究表明，JNK相互作用蛋白3(JIP3)

6、是果蠅Sunday driver以及線蟲UNC-16的一種同源體。上述兩種都是在依賴kinesin的順軸突轉運中作為銜接蛋白的，作為它們的同源體，JIP3是否也能作為銜接蛋白介導某種蛋白與kinesin結合進行順軸突轉運呢?已有文獻報道，JNK3能夠與JIP3結合從而沿著軸突進行順軸突轉運，而JIP3能否和其他的運載物直接結合并且介導它們的順向轉運還不清楚。
　　 研究目的:
　　 1.研究TrkB受體順軸突轉運的機制，

7、是否有特異的銜接蛋白介導
　　 2.TrkB受體在神經元軸突和樹突中順向轉運的機制是否相同
　　 3.通過對轉運機制的調控是否能影響到BDNF引起的后續(xù)信號通路，甚至對神經元生理功能產生影響
　　 研究方法:
　　 1.經典坐骨神經結扎實驗
　　 坐骨神經結扎實驗是一種很成熟的能夠從生化水平和免疫組化水平鑒定軸突內轉運的分子的體內試驗方法，因為坐骨神經組織中富含有長軸突和一部分施旺細胞，對于研究體

8、內的軸突物質轉運是很好的方法。成年雄性大鼠麻醉后，將其一側坐骨神經用5-0線結扎，一天后，取結扎口附近的坐骨神經提取蛋白進行western blot試驗檢測其中的蛋白的水平，并取對照的未結扎的坐骨神經組織提取蛋白作為對照組，比較其蛋白水平差異，從而進行蛋白轉運趨勢分析。亦可將結扎口附近組織取材縱向冰凍切片，然后進行免疫組織化學實驗分析其中的蛋白轉運趨勢。
　　 2.免疫熒光分析方法
　　 海馬神經元體外培養(yǎng)第5天，用4％

9、多聚甲醛固定10分鐘，PBS洗3次后0.4％Triton透化10分鐘，再次PBS洗后用10％山羊血清封閉一小時，然后加一抗4攝氏度孵育過夜，PBS洗3次后加熒光二抗，最后PBS洗后加防熒光粹滅劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察蛋白的定位情況，并用MetaMorph軟件進行熒光定量分析。
　　 3.免疫共沉淀實驗分析蛋白蛋白相互作用
　　 HEK293細胞電轉染質粒后48小時，用加有合適濃度的蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液充分裂解細胞，

10、裂解液在4攝氏度條件下以14000轉/分鐘的速度離心15分鐘，在可溶性的上清蛋白混合液中加入一抗孵育，4攝氏度2小時以上，然后用結合有細菌蛋白A或者蛋白G的瓊脂糖珠子與蛋白復合體充分混合，由于蛋白A或者蛋白G能夠特異的與人和哺乳動物抗體(主要是IgG)的FC區(qū)結合，所以就能形成相互作用蛋白復合體/抗體/蛋白A或蛋白G/瓊脂糖珠子復合體了。經低速離心收集結合了蛋白A或者蛋白G的瓊脂糖珠子，用細胞裂解液洗去非特異性結合的蛋白后，就可以進行S

11、DS-PAGE電泳，westernblot蛋白印跡分析相互作用的蛋白了。
　　 為了研究體內蛋白相互作用，取大鼠大腦勻漿，提取蛋白，測濃度后，每個反應管在10mg總蛋白中加入內源性JIP3一抗孵育，用結合有蛋白G的瓊脂糖珠子4攝氏度充分結合蛋白復合體，經低速離心收集后可以進行SDS-PAGE電泳，westernblot蛋白印跡，用內源性TrkB、KLC1抗體檢測相互作用了。也可以反過來，用內源性KLC1抗體進行一抗孵育，同樣步驟

12、，最后用JIP3、TrkB抗體檢測相互作用。
　　 4.GST融合蛋白沉降技術
　　 表達TrkB受體JM區(qū)的JM1(454-465)；JM2(454-485)；JM3(454-508)；JM(454-537)的cDNA片段被克隆入pGEX-4T-1載體，純化出帶有GST探針的純化蛋白能夠與谷胱甘肽瓊脂糖珠結合，His-JIP3-CC1(amino acids451-520)蛋白表達和純化后與上述結合有GST探針融合蛋白

13、的谷胱甘肽瓊脂糖珠充分孵育，以使蛋白結合。獲得的混合物經洗滌后，用過量游離的谷胱甘肽洗脫，煮沸，經SDS-PAGE電泳后，考馬斯亮藍染色分析蛋白結合或者用His抗體免疫印跡法分析蛋白結合。
　　 5.活細胞成像技術
　　 用于進行活細胞成像的海馬神經元取材后計數用電轉儀轉染帶有熒光的TrkB質粒后在用PDL鋪板的玻璃底皿中培養(yǎng)5天，然后將轉染細胞放置在尼康TE2000熒光顯微鏡下用40倍油鏡觀察，選擇具有較健康的形態(tài)的神

14、經元細胞進行觀察。每一秒拍攝一張熒光照片共拍攝一分鐘記錄囊泡的運動，用Metamorph軟件對囊泡運動進行統(tǒng)計分析。順向運動，逆向運動，雙向運動以及靜止不動的囊泡的運動速度被計算出來。每次實驗中都要記錄和統(tǒng)計至少80到120個囊泡的運動情況，統(tǒng)計求平均值，數據用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析，且這些實驗結果至少重復3次以上。
　　 6.絲狀偽足計數
　　 絲狀偽足被定義為神經元上長度小于10微米的小突起，因為我們

15、使用的神經元是培養(yǎng)5天的神經元，樹突棘還未長出。絲狀偽足的計數是在每個處理組中隨機選取35個以上的神經細胞，統(tǒng)計其軸突和若干個樹突上一段30至80微米長度的距離上絲狀偽足的個數，然后算出其密度值(個數/10微米)，每個獨立實驗至少重復3次，最后將其密度值用統(tǒng)計學軟件進行分析。
　　 結果:
　　 1.TrkB受體兩種亞型(TrkB-FL和TrkB.T1)在大鼠坐骨神經內都有順軸突轉運趨勢
　　 成年大鼠坐骨神經中

16、段結扎一天后，取結扎口附近的坐骨神經提取蛋白進行western blot試驗檢測其中的TrkB-FL和TrkB.T1的水平發(fā)現：相對于非結扎側坐骨神經，TrkB-FL的量在結扎口的近端增多(代表順軸突轉運)，在結扎口的遠端也增多(代表逆向軸突轉運)。從而驗證了以前文獻的報道：TrkB受體既存在順軸突轉運也存在逆軸突轉運。此外，還發(fā)現TrkB受體的截短突變體TrkB.T1(缺少了酪氨酸激酶區(qū))也能夠進行順向轉運，有文獻報道，TrkB受體可

17、以通過其酪氨酸激酶區(qū)與Slp1/Rab27B/CRMP-2/kinesin-1結合而進行順向軸突轉運(1)，而本實驗中發(fā)現TrkB受體的截短突變體TrkB.T1(缺少了酪氨酸激酶區(qū))也能夠進行順向轉運，說明了存在有不依賴于TrkB受體的酪氨酸激酶的轉運機制存在；目前已知TrkB受體與其截短突變體TrkB.T1在近膜區(qū)有12個氨基酸序列是完全相同的，而這12個氨基酸也許在TrkB受體順軸突轉運機制中起到關鍵性的作用。通過用TrkB受體全長

18、型與TrkB.T1的共同12個氨基酸序列做成誘餌進行酵母雙雜交試驗，發(fā)現了35個陽性克隆，其中3種都是編碼JIP3蛋白的(結果未顯示)。而JIP3蛋白已被發(fā)現在依賴于kinesin-1的順向轉運中起到銜接蛋白的作用，因此我們推測JIP3蛋白能夠介導TrkB受體順向轉運。
　　 2.JIP3與TrkB在體外與體內都存在有部分共定位
　　 首先將海馬神經元細胞體外培養(yǎng)5天，用免疫熒光法看內源性JIP3與TrkB在神經元細胞內

19、的亞細胞定位，結果表明：含有TrkB受體的囊泡分布于體外培養(yǎng)的神經元的核周區(qū)域以及軸突和樹突分布區(qū)，且與JIP3的分布情況存在部分共定位。為了進一步驗證其在體內的共定位情況，我們將大鼠坐骨神經結扎一天后，取材切片進行免疫組化染色，觀察到TrkB受體在結扎口近端有明顯的聚集，且與JIP3蛋白有較多共定位。
　　 然后我們用免疫共沉淀法檢測JIP3與TrkB是否形成復合體。①在HEK29細胞中過表達各種質粒并進行免疫共沉淀實驗，結果

20、顯示Flag-TrkB-FL和Flag-TrkB.T1都可以和HA-JIP3形成復合體；但是同等量的情況下Flag-TrkB.T1與HA-JIP3結合比Flag-TrkB-FL結合要弱。②我們還進行了生理條件下的免疫共沉淀實驗，來進一步檢測JIP3與TrkB是否形成一個復合體。取大鼠大腦勻漿，用內源性JIP3抗體進行免疫共沉淀實驗，然后用內源性KLC1抗體、內源性TrkB抗體進行檢測，結果表明TrkB/JIP3/KLC1形成一個復合體。

21、
　　 3.JIP3是介導TrkB與KLC1結合的銜接蛋白，并與二者形成TrkB/JIP3/KLC1復合體
　　 為了研究究竟哪個分子是介導TrkB與KLC1結合的中間橋梁，我們進行3個分子共表達的免疫共沉淀實驗，結果發(fā)現：JIP3是介導TrkB與KLC1結合的銜接蛋白，但敲除掉JIP3表達時，TrkB與KLC1結合并未完全消失；而同時敲除JIP3和Rab27B時，TrkB-FL與KLC1的結合能力比單敲除掉JIP3或者

22、單敲除掉Rab27B時降低的更多。以上結果表明：TrkB-FL既可以通過JIP3蛋白的銜接作用與KLC1相互作用，也可以通過Sip1/Rab27B/CRMP-2復合體與KLC1相互作用，這兩種方式是同時存在的。
　　 4.TrkB受體中與JIP3蛋白結合的精確區(qū)域是近膜1區(qū)的12個氨基酸，它們是TrkB受體與JIP3蛋白結合的必要條件和充分條件
　　 為了研究TrkB受體中與JIP3蛋白結合的精確區(qū)域，我們構建了以下Tr

23、kB突變體：JM區(qū)只含有這12個氨基酸的突變體FlagTrkB-JM1，JM區(qū)完全缺失的突變體FlagTrkB-JM0，以及僅缺失這12個氨基酸的缺失突變體FlagTrkB△JM1。免疫共沉淀結果表明：TrkB-JM1不僅是TrkB/JIP3結合的必要條件，同樣也是TrkB/JIP3結合的充分條件。而嫁接了TrkB-JM2，TrkB-JM3后能增強TrkB/JIP3的結合，從而解釋了之前的實驗結果(同等量的情況下TrkB.T1與JIP3

24、結合比-FL結合要弱)。
　　 眾所周知，酪氨酸激酶受體有常見的三種形式：TrkA，TrkB，TrkC。因此我們通過免疫共沉淀實驗來研究JIP3蛋白是否與這3種受體都有相互作用。結果發(fā)現：JIP3除了與TrkB受體結合以外，還能與TrkC受體結合，而不與TrkA結合。
　　 5.JIP3蛋白分別通過其CC1區(qū)域和LZ區(qū)域與TrkB受體和KLC1結合，且JIP3CC1與TrkBJM1區(qū)域是直接結合的
　　 為了尋找

25、JIP3蛋白中與TrkB受體結合的的精確區(qū)域，我們構建了一系列的JIP3缺失突變體，并且用免疫共沉淀方法檢測其與TrkB-FL受體結合的能力。結果表明：JIP3蛋白的424-625氨基酸序列對JIP3蛋白和TrkB受體的結合起到關鍵性作用。這段氨基酸序列中包含有3個保守序列，分別是：亮氨酸拉鏈區(qū)(leucine Zipper-like domain，LZ)，環(huán)區(qū)1(coiled-coil1，CC1)，環(huán)區(qū)2(coiled-coil2，C

26、C2)。為了尋找更加精確的結合區(qū)域，我們構建了分別缺失LZ，CC1，CC2的JIP3突變體，免疫共沉淀實驗結果表明：JIP3蛋白分別通過其CC1區(qū)域和LZ區(qū)域與TrkB受體和KLC1分子馬達結合。且缺失了CC1區(qū)域JIP3蛋白能夠作為一個功能缺失的突變體(dominant negative，DN)來研究JIP3對TrkB受體的轉運和調節(jié)。
　　 為了驗證TrkB與JIP3是直接結合而非間接的，我們運用體外的GST融合蛋白沉降技術

27、來檢測TrkB/JIP3的相互作用，實驗結果顯示：JIP3-CC1區(qū)域能夠直接與TrkB-JM1區(qū)域結合；TrkB-JM2，TrkB-JM3之間的區(qū)域能夠增強這種結合作用，這與我們之前的免疫共沉淀結果是相符合的。
　　 6.JIP3蛋白介導了TrkB受體在神經元軸突中的順向轉運而不影響樹突中的順向轉運
　　 前面我們的實驗結果表明：TrkB/JIP3/KLC1形成一個復合體，我們猜測JIP3蛋白能夠介導TrkB受體利用K

28、LC1進行順向轉運。為證實此猜想，我們用免疫熒光法檢測過表達JIP3，或者敲除掉內源性JIP3對TrkB-FL-GFP在分化的PC12細胞末梢的分布的影響。在該實驗的對照組(轉染隨機無意義干擾RNA組)中，TrkB-FL-GFP可以聚集到分化的PC12細胞末梢，而轉染特異性針對JIP3序列的干擾RNA(siJIP3)或者JIP3的功能缺失體JIP3△CC1后，到達分化的PC12細胞末梢的TrkB-F-GFP顯著減少。與之相反，過表達JI

29、P3能夠顯著增加到達分化的PC12細胞末梢的TrkB-FL-GFP量。以上結果表明：JIP3能夠促進分化的PC12細胞中TrkB-FL-GFP的順向轉運。
　　 為了研究內源性表達的TrkB受體，在神經元中的轉運是否能夠被JIP3增強，我們在體外培養(yǎng)的原代海馬神經元中重復了以上實驗。統(tǒng)計結果顯示：過表達JIP3能夠使得轉運到軸突末梢的TrkB受體顯著增多，反之亦然，過表達JIP3的功能缺失體JIP3△CC1或者轉染了siJIP3

30、能夠使得轉運到軸突末梢的TrkB受體明顯減少，而以上3種處理方式對于到達樹突末梢的TrkB受體不受影響。同時敲除JIP3和Rab27B，與單獨敲除JIP3或Rab27B組相比，可以使到達軸突末梢的TrkB受體減少到更低。這再次驗證了之前的結果，即TrkB-FL既可以通過JIP3蛋白的銜接作用與KLC1相互作用，也可以通過Slp1/Rab27B/CRMP-2復合體與KLC1相互作用，這兩種機制是同時存在的，且是亞相加(subadditiv

31、e)的。
　　 7.活細胞成像結果：JIP3對軸突中TrkB受體順向轉運起特異性作用，而對樹突中TrkB受體運動無影響
　　 為了進一步研究JIP3對TrkB受體順向轉運的影響，我們將神經元細胞轉染TrkB-FL-mRFP后體外培養(yǎng)五天，用熒光顯微鏡觀測含有TrkB-FL-mRFP的囊泡轉運情況，結果顯示囊泡在神經元軸突中運動更加活躍，可以見到囊泡沿著軸突進行順向、逆向、雙向轉運以及靜止不動，而在樹突中運動要相對少的多。

32、為了便于定量分析，我們人為的將含有TrkB-FL-mRFP的囊泡在神經元中的運動情況可以分為四類：(1)順向轉運的，(2)逆向轉運的，(3)雙向轉運的，(4)相對靜止不動的。統(tǒng)計結果顯示：(1)軸突和樹突中以上四種運動方式的囊泡所占比例大致相似。(2)與對照組相比，siJIP3組中含有TrkB-FL-mRFP的囊泡進行順向軸突轉運的比例明顯減少，而軸突中靜止不動的囊泡比例相應升高。(3)siJIP3組中樹突中的4種囊泡的比例不變。以上結

33、果表明：JIP3特異性的對軸突中TrkB受體順向轉運起作用，而對樹突中TrkB受體運動無影響。
　　 8.依賴于JIP3的TrkB受體順向轉運，對于BDNF的信號轉導有重要作用
　　 為了研究JIP3介導的TrkB受體順向轉運對于后續(xù)功能的影響，我們研究了JIP3是否影響B(tài)DNF介導的信號轉導。在海馬神經元培養(yǎng)液中加入50ng/mlBDNF15分鐘，來激活Erk1/2是一種很好的建立的TrkB受體激活的方法。由于神經元細

34、胞的轉染效率低，我們用免疫細胞化學的方法來檢測BDNF激活的磷酸化的Erk1/2(p Erk1/2)。敲除掉內源性JIP3后，在總Erk1/2水平不變的情況下，磷酸化Erk1/2水平降低了大約35％，反之，在過表達JIP3組中，Erk1/2磷酸化水平升高了大約40％。JIP3對于BDNF誘導的Erk1/2磷酸化水平的影響，在軸突末梢處比整個細胞的影響更為明顯。
　　 9.JIP3不能夠促進TrkB受體的細胞膜表面插入
　　

35、 根據本實驗室以前的文獻報道(2)，我們使用了TrkB受體細胞膜表面分布比例的熒光定量方法：海馬神經元轉染Flag-TrkB-FL-GFP，以及各組質粒ScramblesiRNA，HAJIP3，siJIP3，siRab27B，并觀察神經元軸突末梢總的TrkB量以及膜表面的TrkB量的變化情況。結果顯示：過表達JIP3或者敲除掉JIP3能夠使得軸突遠端的總TrkB-FL以及膜表面的TrkB-FL都相應的增多或者減少，而不論何種干預，Tr

36、kB-FL膜表面/總量的比值保持不變。以上結果表明：順軸突轉運的TrkB-FL能夠成功插入到膜表面而且JIP3對TrkB受體的膜表面插入無顯著影響。
　　 10.JIP3能夠影響B(tài)DNF作用下海馬神經元軸突上絲狀偽足的形成
　　 已有文獻表明(3)，BDNF/TrkB信號能夠驅動活性依賴的突觸形態(tài)發(fā)生。為了研究JIP3依賴的TrkB轉運在BDNF引發(fā)的突觸形態(tài)發(fā)生中的作用，我們研究了JIP3是否能調節(jié)BDNF刺激引起的絲

37、狀偽足形成。將海馬神經元分別轉染Scramble siRNA，siJIP3，JIP3△CC1，JIP3FL后，用BDNF刺激20分鐘，然后固定細胞檢測絲狀偽足的形成情況并加以統(tǒng)計。統(tǒng)計結果表明：siJIP3組和JIP3△CC1組的BDNF刺激后絲狀偽足沒有明顯增加，而過表達JIP3組BDNF刺激后軸突上絲狀偽足數目明顯增多，且有統(tǒng)計學差異。與之相反，JIP3對于樹突上絲狀偽足數目的增加沒有任何調節(jié)作用。以上結果表明，JIP3可以選擇性影

38、響軸突上絲狀偽足的形成，且是由于JIP3對BDNF信號的影響來調控的。
　　 結論:
　　 1、JIP3是介導TrkB與KLC1結合的銜接蛋白，并與其形成TrkB/JIP3/KLC1復合體。
　　 2、TrkB受體中與JIP3蛋白結合的精確區(qū)域是近膜區(qū)的12個氨基酸，它們是TrkB受體與JIP3蛋白結合的必要條件和充分條件。
　　 3、JIP3蛋白的CC1區(qū)域和LZ區(qū)域分別與TrkB與KLC1結合，且JI

39、P3-CC1區(qū)域與TrkB-JM1區(qū)域是直接結合的。
　　 4、JIP3蛋白介導了TrkB受體在神經元軸突中的順向轉運，而不影響樹突中的順向轉運。
　　 5、依賴于JIP3的TrkB受體順向轉運，對于BDNF的信號轉導有重要作用。創(chuàng)新點
　　 創(chuàng)新點一，本研究中首次發(fā)現：JIP3能夠直接與TrkB受體結合并且將TrkB受體與驅動蛋白kinesin-1相連接從而沿著微管進行順向轉運。
　　 創(chuàng)新點二，JIP