糖尿病大鼠表皮干細胞β-catenin和cyclinD1的表達及其在創(chuàng)面修復(fù)中的作用研究.pdf

1、糖尿病(diabetic mellitus，DM)患者皮膚易受損傷、且損傷后創(chuàng)面愈合延遲或不愈合，目前仍是臨床常見難題。近期研究證實，表皮干細胞(Epidermal Stem Cells，ESCs)作為皮膚組織的特異性干細胞，是皮膚及其附屬器發(fā)生、修復(fù)、改建的源泉，在正常皮膚再生和創(chuàng)面愈合中發(fā)揮重要作用；糖尿病創(chuàng)面表皮干細胞數(shù)量顯著減少、活性明顯降低，存在局部特有的“干細胞庫干涸”現(xiàn)象。由此提示，表皮干細胞增殖分化特性的改變可能是糖尿病

2、創(chuàng)面難愈的重要原因之一。
　　 β-連環(huán)素(β-catenin)是一種細胞骨架蛋白，由位于染色體3p21的CTNNB1基因編碼。業(yè)已研究證實β-catenin能夠促進腸道上皮干細胞增殖分化，并參與腸黏膜受損后的修復(fù)過程，表明β-catenin與成體干細胞的增殖分化密切相關(guān)。Wnt和β-catenin表達增強，表皮細胞的增殖分化和遷移能力增強，創(chuàng)面愈合加快。但β-catenin和Cyclin D1在糖尿病皮膚表皮干細胞中的表達及其

3、在創(chuàng)面修復(fù)中的作用尚不清楚。
　　 本實驗采用糖尿病大鼠模型，觀察糖尿病大鼠皮膚與正常大鼠皮膚組織表皮干細胞定位、β-catenin和cyclinD1的表達差異；采用表皮干細胞體外培養(yǎng)模型，研究糖尿病大鼠皮膚表皮干細胞β-catenin和cyclinD1基因及其蛋白的表達特征；采用糖尿病大鼠創(chuàng)面模型，探究表皮干細胞移植對糖尿病創(chuàng)面愈合的影響以及β-catenin和cyclin D1的表達變化，為其在創(chuàng)面修復(fù)中的進一步應(yīng)用奠定實驗

4、基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 第一部分糖尿病大鼠皮膚組織表皮干細胞定位及β-catenin和cyclinD1表達檢測
　　 目的：觀察糖尿病大鼠皮膚組織表皮干細胞定位和β-catenin、cyclinD1及其相關(guān)蛋白的表達檢測，探討其在糖尿病皮肽難愈創(chuàng)面修復(fù)中的意義。
　　 方法：20只SD大鼠隨機分為DM組和正常對照組。DM組大鼠采用一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ，65 mg/kg)制備D

5、M大鼠模型，成模第四周取大鼠背部全層皮膚，取兩組大鼠胰腺組織，HE染色觀察胰島組織學(xué)變化。并取正常皮膚標(biāo)本作為對照，行HE染色及β-catenin、cyclinD1、Wnt1、角蛋白19(keratin19，K19)、β1整合素(β1-integrin)和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)免疫組織化學(xué)染色，圖像分析軟件測量陽性細胞積分吸光度(integral absorban

6、ce，IA)。
　　 結(jié)果：DM大鼠連續(xù)4周血糖監(jiān)測均≥16.7 mmol/L且血糖波動小，DM模型具良好穩(wěn)定性，建模成功率為90％。DM組胰腺HE染色可見胰島細胞數(shù)目明顯減少，出現(xiàn)變性壞死；對照組胰島細胞結(jié)構(gòu)清楚，無變性壞死。表皮基底層均可見表皮干細胞的標(biāo)志物K19和β1-integrin陽性表達，β-catenin、cyclinD1、Wnt1、PCNA陽性細胞集中在表皮基底層，但DM組皮膚組織表皮β-catenin、cycl

7、inD1、Wnt1、PCNA、K19和β1-integrin的表達均顯著低于正常對照組皮膚(P<0.01)。DM組與正常對照組大鼠皮膚中β-catenin[(169.78±37.29)，(217.88±23.51)，P<0.01]、cyclinD1[(156.37±32.46)，(198.26±22.15)，P<0.01]、Wnt1[(138.63±23.45)，(175.82±25.12)，P<0.01]、PCNA[(143.17±1

8、9.82)，(175.05±20.84)，P<0.01]、K19[(139.54±20.69)，(168.96±17.97)，P<0.01]和β1-integrin[(150.58±19.98)，(181.79±15.94)，P<0.01]的陽性細胞積分吸光度相比差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：糖尿病大鼠皮膚表皮干細胞主要位于表皮基底層，β-catenin和cyclinD1陽性表達區(qū)域和信號強度與表皮干細胞定位分布及陽性表

9、達強度相一致。提示糖尿病大鼠皮膚中表皮干細胞數(shù)量減少和β-catenin、cyclinD1的表達減弱可能與糖尿病皮膚修復(fù)能力的降低密切相關(guān)。
　　 第二部分體外培養(yǎng)觀察糖尿病大鼠表皮干細胞β-catenin和cyclinD1的表達特征
　　 目的：在體外培養(yǎng)條件下，觀察糖尿病皮膚表皮干細胞β-catenin、cyclinD1及其增殖分化相關(guān)蛋白的表達特征，以探究DM皮膚創(chuàng)面難愈的潛在機制。
　　 方法：40只SD

10、雄性大鼠隨機分為DM組和正常對照組。DM組大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素65mg/kg制備DM大鼠模型，正常對照組不作處理。注射后4周取兩組背部全層皮肽，分離培養(yǎng)ESCs，流式細胞儀檢測細胞周期，細胞接種1周后檢測兩組細胞克隆形成率。分別取兩組ESCs行免疫細胞化學(xué)染色鑒定β-catenin、cyclinD1、Wnt1、PCNA、K19和β1-integrin陽性表達；采用RT-PCR和Western blot檢測β-catenin、cy

11、clinD1、Wnt1mRNA和蛋白表達。
　　 結(jié)果：倒置相差顯微鏡下觀察，DM組與正常對照組相比，表皮干細胞數(shù)量明顯減少，生長速度緩慢，DM組ESCs克隆形成率為6.43％(12.87±2.03/200％)明顯低于正常對照組的11.37％(22.75±3.24/200％)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。流式細胞儀分析DM組ESCs88.89％處于靜息期/DNA合成前期(G0/G1期)，凋亡細胞數(shù)3.98％；正常對照組

12、ESCs91.50％處于G0/G1期，無凋亡細胞。DM組大鼠ESCs的K19、β1-integrin、β-catenin、cyclinD1、Wnt1及PCNA陽性表達的積分吸光度(IA)值分別為82.63±14.77、21.59±4.71、76.49±6.58、69.35±5.82、32.57±6.13、90.77±12.44，均低于正常對照組(分別為151.24±42.83、54.48±17.43、116.39±9.26、105.47

13、±7.52、71.29±8.25、110.62±20.67)，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。DM組表皮干細胞β-catenin[(0.556±0.017)，(0.850±0.059)，P<0.01]和cyclinD1[(0.682±0.023)，(0.887±0.038)，P<0.01]mRNA表達水平均顯著低于正常對照組。Western blot檢測β-catenin和cyclinD1在兩組均有表達，但DM組的表達強度(0.5

14、83±0.054，0.843±0.037)低于正常對照組(1.128±0.077，1.307±0.072)(P<0.01)。
　　 結(jié)論：1.兩組體外分離培養(yǎng)的表皮干細胞呈克隆性生長，G0/G1期細胞比例高，β1-integrin和K19免疫細胞化學(xué)染色均呈陽性表達，表明在本實驗培養(yǎng)條件下分離培養(yǎng)的表皮干細胞具有干細胞的生物學(xué)特性。但DM組ESCs生長速度緩慢，克隆形成能力減弱。
　　 2.糖尿病大鼠皮膚表皮干細胞β-c

15、atenin和cyclinD1mRNA及其蛋白表達均明顯降低。提示β-catenin和cyclinD1表達減弱引起糖尿病大鼠皮膚表皮干細胞增殖能力明顯下降和數(shù)量顯著減少，可能是導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)面難愈的重要機制之一。
　　 第三部分表皮干細胞移植對糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合的影響及β-catenin和cyclinD1的表達變化
　　 目的：觀察表皮干細胞移植對糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合的影響及β-catenin和cyclin D1的表達變化，

16、為糖尿病難愈創(chuàng)面的治療提供新思路。
　　 方法：雄性SD大鼠20只用于建立糖尿病模型，雄性SD大鼠10只用于制備表皮干細胞。分離培養(yǎng)及鑒定SD大鼠ESCs，并用5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)標(biāo)記。建立糖尿病SD大鼠創(chuàng)面模型，隨機分為A、B、C三組，A組創(chuàng)面移植羊膜負載BrdU標(biāo)記的ESCs；B組創(chuàng)面移植羊膜；C組為空白對照組，創(chuàng)面未給予干預(yù)。觀察創(chuàng)面愈合情況、計算創(chuàng)面愈合率，HE及免疫組織化學(xué)SP法檢測創(chuàng)面愈合組織中BrdU、K1

17、9、β1-integrin、β-catenin、cyclinD1、Wnt1及PCNA的表達。用圖像分析軟件測量陽性細胞積分吸光度。
　　 結(jié)果：與另兩組相比，表皮干細胞移植組新生表皮下膠原分布均勻，排列較整齊，在不同觀察時期的創(chuàng)面愈合率明顯增高且組間比較差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。表皮干細胞移植組創(chuàng)面及新生表皮中可見BrdU陽性細胞，而另兩組皮膚創(chuàng)面組織中始終未見BrdU陽性細胞。各組創(chuàng)面組織中可見K19、β1-in

18、tegrin、β-catenin、cyclinD1、Wnt1和PCNA陽性細胞表達，但A組的陽性細胞積分吸光度與B、C組比較差異顯著(P<0.01)。
　　 結(jié)論：表皮干細胞移植可有效促進糖尿病大鼠創(chuàng)面的愈合，且在新生表皮基底層表皮干細胞標(biāo)志物K19、β1-integrin與β-catenin、CyclinD1的表達均增強。提示β-catenin和CyclinD1活性表達的變化可能是表皮干細胞促進糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合的重要機制之一