桔小實(shí)蠅γ-氨基丁酸相關(guān)酶的生化及分子毒理學(xué)特性研究.pdf

1、桔小實(shí)蠅Bactroceradorsalis(Hendel)隸屬于雙翅目Diptera，實(shí)蠅科Tephritidae，是一種危險(xiǎn)的農(nóng)業(yè)害蟲。因其世代歷期短、繁殖力強(qiáng)、加之殺蟲劑的不合理使用，桔小實(shí)蠅已對(duì)多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗性。目前，有關(guān)桔小實(shí)蠅的抗性監(jiān)測(cè)、機(jī)理和治理的研究日益增多，研究焦點(diǎn)集中于桔小實(shí)蠅解毒酶(P450s、GSTs和CarEs等)的生化毒理學(xué)及靶標(biāo)(如AChR)的分子生物學(xué)特性等方面，而對(duì)其他昆蟲中研究非常多的γ-氨基丁酸

2、受體(GABA)及相關(guān)酶的生化及分子毒理學(xué)特性還鮮有報(bào)道。
　　 本研究以桔小實(shí)蠅為研究對(duì)象，探討GABA受體及相關(guān)酶在抗藥劑脅迫中的作用。采用局部點(diǎn)滴法測(cè)定了桔小實(shí)蠅福州種群對(duì)阿維菌素的敏感性;在此基礎(chǔ)上，采用酶標(biāo)板滴定法測(cè)定了阿維菌素處理前后，桔小實(shí)蠅體內(nèi)谷氨酸脫羧酶(GAD)和γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T)的比活力變化;此外，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及RACE技術(shù)，開展了GABA受體相關(guān)基因的全長序列克隆，并對(duì)所得基因響應(yīng)阿維菌

3、素刺激的表達(dá)模式進(jìn)行了解析。論文從生理生化和分子生物學(xué)角度分析了桔小實(shí)蠅GABA相關(guān)酶和基因的毒理學(xué)特性。獲得的主要結(jié)果如下:
　　 1、桔小實(shí)蠅對(duì)阿維菌素的敏感性測(cè)定
　　 采用局部點(diǎn)滴法測(cè)定了桔小實(shí)蠅福州種群對(duì)阿維菌素的敏感性，并與東莞、廣州、?？诤屠ッ鞯?個(gè)地理種群的生測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較分析。24h生測(cè)結(jié)果表明，桔小實(shí)蠅昆明種群對(duì)阿維菌素最敏感，福州種群次之，東莞種群最不敏感。與桔小實(shí)蠅東莞、廣州和海口種群相比，昆明

4、和福州2個(gè)種群對(duì)阿維菌素敏感性差異均達(dá)到顯著水平。根據(jù)阿維菌素的作用特點(diǎn)，測(cè)定了72h的敏感性，LD50僅0.475ng/fly。
　　 2、桔小實(shí)蠅GABA相關(guān)酶的生化毒理學(xué)特性研究
　　 2.1、GABA含量測(cè)定
　　 采用HPLC法測(cè)定了阿維菌素處理前后桔小實(shí)蠅的GABA含量。結(jié)果表明，經(jīng)阿維菌素LD10的劑量處理24h后，桔小實(shí)蠅GABA含量升高，但差異不顯著（1.13倍，P＞0.05）;而經(jīng)LD50的劑

5、量處理24h后，GABA含量顯著升高(1.34倍，P＜0.05)。初步推測(cè)桔小實(shí)蠅通過保持高含量的GABA來應(yīng)對(duì)阿維菌素的脅迫。
　　 2.2、GABA-T和GAD比活力測(cè)定
　　 采用微量滴度酶標(biāo)板法測(cè)定了桔小實(shí)蠅與GABA含量相關(guān)的GABA-T和GAD比活力。結(jié)果顯示，經(jīng)過阿維菌素不同劑量(LD10和LD50)處理后，GABA-T比活力無顯著性變化，而GAD的比活力與阿維菌素的處理劑量和處理時(shí)間成正相關(guān)。表明GABA

6、含量升高是GAD比活力增強(qiáng)的結(jié)果。
　　 3、桔小實(shí)蠅GABA相關(guān)酶的分子生物學(xué)特性研究
　　 3.1、GABA受體相關(guān)基因的克隆
　　 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)合RT-PCR和RACE技術(shù)，從桔小實(shí)蠅體內(nèi)克隆獲得GABA受體相關(guān)的2個(gè)基因cDNA全長和3個(gè)基因的片段序列。上述基因提交至GenBank后的名稱和登錄號(hào)分別為BdGAP(JQ796071.1)、BdGD1(KC763804)和BdGAF(KC763801)

7、、BdGBR(KC763802)、BdSCD(KC763803)。應(yīng)用Protparam、Scanprosite等生物信息學(xué)軟件分析了預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。此外，采用軟件MEGA5.0最大似然法(Maximum-likelihoodmethod，ML)構(gòu)建了桔小實(shí)蠅上述5個(gè)GABA受體相關(guān)基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示它們和其它雙翅目昆蟲的親緣關(guān)系非常近。
　　 3.2、GABA受體相關(guān)基因的表達(dá)模式解析
　　 以桔小實(shí)蠅α

8、-Tubulin作為內(nèi)參基因，采用qPCR技術(shù)測(cè)定了BdGAF、BdGBR、BdSCD和BdGD1在不同發(fā)育階段（卵、幼蟲、蛹和成蟲）、不同體段（頭、胸和腹）以及阿維菌素處理前后的mRNA表達(dá)模式。檢測(cè)結(jié)果表明，桔小實(shí)蠅GAF基因在卵期表達(dá)量最高，GBR、GD1基因在幼蟲期表達(dá)量最高，而SCD基因在成蟲的表達(dá)量最高;不同體段的測(cè)定結(jié)果表明，GBR、SCD在頭部表達(dá)量顯著高于胸部和腹部，GAF基因在各體段表達(dá)量基本一致，而GD1基因在腹部

9、表達(dá)量最高;阿維菌素處理前后的表達(dá)量測(cè)定結(jié)果顯示，以LD50的劑量處理不同時(shí)間后，SCD基因的表達(dá)量變化在1-2倍之間;GAF、GBR和GD1基因在處理后表達(dá)量顯著上升，且隨著處理時(shí)間延長而升高;經(jīng)不同劑量的阿維菌素處理24h后，桔小實(shí)蠅GAF、GBR和SCD基因表達(dá)量較對(duì)照均有顯著上升，且隨著劑量增加而升高，而GD1的表達(dá)量在亞致死劑量LD10處理后上升，在致死中量LD50處理后較對(duì)照卻下降。
　　 研究從生理生化和分子生物學(xué)