落葉松毛蟲酶學特性及生化毒理學研究.pdf

1、落葉松毛蟲(Dendrolimus superans Butler)又稱西伯利亞松毛蟲，隸屬鱗翅目枯葉蛾科，是我國北方針葉樹重要的食葉害蟲之一，經(jīng)常周期性爆發(fā)成災，給林業(yè)生產(chǎn)帶來嚴重的損失。目前有關落葉松毛蟲的研究主要集中在生活習性、預測預報、化學防治、生物防治、物理機械防治以及誘導抗性選育等方面，而關于落葉松毛蟲酶學及生化毒理學的研究尚未見報道。本文從生物化學角度系統(tǒng)分析了乙酰膽堿酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉移酶、超氧化物歧化酶、過

2、氧化氫酶在落葉松毛蟲6齡幼蟲體內的分布特征，通過正交試驗建立了落葉松毛蟲幼蟲乙酰膽堿酯酶的最佳反應條件;比較了落葉松毛蟲幼蟲5種酶對幾種常用農(nóng)藥原藥及制劑的敏感性，分析了殺蟲劑處理后其體內5種酶活性的變化規(guī)律。通過離心、硫酸銨沉淀、離子交換層析、親和層析等方法對乙酰膽堿酯酶和羧酸酯酶進行了純化，并對純化前后羧酸酯酶的酶學性質進行了研究，其結果為高效、低殘留、環(huán)境友好型殺蟲劑的篩選及落葉松毛蟲生化毒理學研究提供理論依據(jù)。
　　1、通

3、過正交試驗設計，分析了酶濃度、底物濃度、反應時間、反應溫度及pH值等因素對落葉松毛蟲乙酰膽堿酯酶活性的影響，最終確定落葉松毛蟲乙酰膽堿酯酶反應的最佳條件為酶液質量濃度0.2 g/mL、底物濃度0.8 mmol/L、反應體系pH7.5、水浴溫度35℃和反應時間5min;
　　2、落葉松毛蟲6齡幼蟲頭部、中腸、脂肪和表皮4個組織中AChE、CarE、GST、SOD及CAT活性的分布特征為:AChE分布相對比較均勻，其中脂肪體中的含量略

4、高于其它組織，占軀體的29.01％，而表皮含量略低于其它組織，占21.16％;CarE主要集中在中腸，占軀體的61.31％，頭部分布最少，僅占軀體的6.37％;GST則主要分布在脂肪體中，占軀體的36.15％，頭部分布最少，僅占軀體的6.58％;頭部的SOD含量最多，占軀體的39.79％，表皮最少，占15.30％; CAT頭部含量最少，僅占軀體的3.66％，脂肪體中含量最多，占38.17％;
　　3、測定了農(nóng)藥原藥和制劑對落葉松毛

5、蟲6齡幼蟲5種酶離體活性的影響，其結果顯示:在殺蟲劑制劑中，2種有機磷（敵敵畏和辛硫磷）對落葉松毛蟲幼蟲AChE離體活性抑制程度顯著強于其它制劑，其抑制中濃度分別為1.050×10-9、7.144×10-8 mg/mL;辛硫磷、敵敵畏對落葉松毛蟲幼蟲CarE離體活性抑制作用最強;敵敵畏制劑對落葉松毛蟲幼蟲GST抑制作用最強（IC50=8.737×10-6 mg/mL），其次為高效氯氟氰菊酯制劑(IC50=7.174×10-3 mg/mL

6、);高效氯氰菊酯和高效氯氟氰菊酯殺蟲劑制劑對落葉松毛蟲SOD活性抑制性最強，其IC50分別為1.879×10-1和6.115×10-1mg/mL，敵敵畏和辛硫磷對SOD離體活力抑制程度最弱，在質量濃度低于0.05 mg/mL時表現(xiàn)為誘導激活作用;滅幼脲和阿維菌素對CAT活性抑制最強，IC50分別為2.233 mg/mL和7.672mg/mL。在供試農(nóng)藥原藥中，2種有機磷原藥（敵敵畏、氧化樂果）對落葉松毛蟲幼蟲AChE離體活性抑制程度顯著

7、強于其它原藥及制劑，其抑制中濃度分別為4.762×10-3 mg/mL和2.369×10-3 mg/mL;敵敵畏、氧化樂果對落葉松毛蟲幼蟲CarE離體活性抑制作用最強;2種擬除蟲菊酯類原藥（百樹菊酯和高效氯氟氰菊酯）對落葉松毛蟲幼蟲GST離體抑制作用最強;高效氯氟氰菊酯對離體SOD活性的抑制作用最強，而吡蟲啉最弱;阿維菌素和高效氯氟氰菊酯對離體CAT活性的抑制作用最強，氧化樂果抑制力最弱。
　　4、利用點滴法低劑量農(nóng)藥原藥和制劑處

8、理落葉松毛蟲6齡幼蟲敏感品系，研究了供試昆蟲體內AChE、CarE、GST、SOD和CAT5種酶活性的變化與處理時間的關系。結果表明，原藥與制劑處理落葉松毛蟲6齡幼蟲后體內5種酶活性均發(fā)生了相應變化，且存在顯著的時間效應，但處理時間與酶的比活力并非呈線性關系。在同一時間點，殺蟲劑的種類、作用機理、殺蟲劑作用時間與5種酶的比活力密切相關。
　　5、采用硫酸銨沉淀、凝膠層析和親和層析等方法分離純化了落葉松毛蟲6齡幼蟲體內的AChE和C

9、arE，并比較分析了粗酶液和純化CarE的生化特性。結果表明，60％硫酸銨沉淀、Sephadex G-25凝膠層析、Procainamide與CEA親和層析能夠將落葉松毛蟲幼蟲AChE從雜蛋白中較好的純化，但60％硫酸銨沉淀和Sephadex G-25凝膠層析純化效率較低，純化倍數(shù)分別為1.645和11.297倍。CEA親和層析純化效果好于Procainamide親和層析，其純化后的比活力達162.866μmol/min·mg prot

10、ein，純化的倍數(shù)為115.344倍，回收率為16.510％。
　　利用硫酸銨梯度沉淀、凝膠層析、DEAE纖維素離子交換層析和羥基磷灰石親和層析等技術純化了落葉松毛蟲6齡幼蟲CarE，得到純化倍數(shù)為138.348倍，回收率為2.782％的目的蛋白CarE，通過SDS-PAGE估算其分子量約為84.78 kD。以α-NA和β-NA為底物，經(jīng)動力學分析落葉松毛蟲幼蟲粗酶液CarE的Km值分別為8.601×10-5和3.775×10-4

11、 mol/L，是純化酶液的1.989和2.337倍，而CarE純化酶液的Kcat分別為5.824×101和2.306×102min-1，是粗酶液的106.084和135.012倍;落葉松毛蟲6齡幼蟲粗酶液和純化酶液離體CarE對敵敵畏、阿維菌素、高效氯氟氰菊酯均較敏感。敵敵畏對CarE活性抑制作用最強，其對純化酶液CarE的IC50為1.105×10-4 mg/mL，是粗酶液33.394倍，而阿維菌素和高效氯氰菊酯對粗酶液CarE的IC