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文檔簡介
1、目的:Bcl-2/腺病毒E1B19kDa結(jié)合蛋白3(BNIP3)是Bcl-2蛋白家族BH3-only亞家族的非典型成員,盡管研究表明BNIP3作為缺氧誘導(dǎo)因子的靶基因在多種疾病過程中承擔著重要的角色,比如心肌缺血,細胞自噬,細胞凋亡,但是關(guān)于BNIP3功能不同的研究往往得出相互矛盾的結(jié)果。本實驗旨在探討B(tài)NIP3在胰腺癌組織標本中的表達及其臨床意義,研究BNIP3在胰腺癌細胞株中的表達及其調(diào)控胰腺癌細胞凋亡的作用和機制。
方法
2、:
(1)利用免疫熒光(IF)及免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測BNIP3在70對胰腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的定位及表達,并分析BNIP3的表達與臨床病理因素、其他凋亡相關(guān)蛋白及腫瘤凋亡及增殖的關(guān)系;
(2)利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)和Western blot檢測 BNIP3在胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1,BxPc-3,CaPan-1,SW1990、CFPAC-1、Patu-8988中的表達情況,分別用siRNA
3、-BNIP3轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞株靶向沉默BNIP3的表達,用BNIP3全基因質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞株上調(diào)其表達,利用RT-PCR和Western blot確認RNAi靶向沉默及質(zhì)粒過表達BNIP3的效果;
(3)沉默BNIP3及上調(diào)其表達后,利用細胞凋亡檢測、線粒體膜電位檢測,細胞活性氧檢測,Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達,研究BNIP3調(diào)控胰腺癌細胞凋亡的作用及機制;
(4)利用甲基化PCR檢測6株胰腺
4、癌細胞的甲基化狀態(tài),去甲基化藥物處理細胞,分析BNIP3甲基化和其表達的相關(guān)性;
(5)利用CHIP實驗分析BNIP3甲基化對缺氧誘導(dǎo)因子和其啟動子區(qū)結(jié)合的影響。
結(jié)果:
(1)BNIP3在胰腺癌組織中的陽性率明顯低于癌旁組織,且兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.457,P<0.001),兩者陽性表達率分別為35.7%和72.9%;BNIP3的表達與臨床病理因素的分析結(jié)果顯示,BNIP3的低表達與腫瘤大小
5、、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤分級無明顯相關(guān),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。胰腺癌組織中BNIP3的表達和促凋亡蛋白表達Bax正相關(guān),和抑凋亡蛋白Bcl-2表達負相關(guān),其低表達與腫瘤細胞增殖活躍、凋亡減少有關(guān);
(2)RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,常氧條件下BNIP3的mRNA和蛋白水平在六株胰腺癌細胞株中除一株低表達外,其余的5株均表
6、達沉默,且缺氧條件培養(yǎng)并未誘導(dǎo)其表達。
(3)通過上調(diào)及下調(diào)BNIP3表達發(fā)現(xiàn)BNIP3可以調(diào)控線粒體途徑相關(guān)凋亡蛋白的表達,和誘導(dǎo)細胞活性氧的產(chǎn)生、線粒體膜電位的下降及細胞凋亡。
(4)甲基化PCR檢測證實 BNIP3啟動子區(qū)的高甲基化和其在胰腺癌中的低表達密切相關(guān),BNIP3啟動子區(qū)的甲基化影響了缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和其啟動子區(qū)缺氧反應(yīng)元件的結(jié)合。
結(jié)論:BNIP3在胰腺癌組織中低表達,BNIP3的
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