miR-150調(diào)控c-Myb和MUC4的表達(dá)在胰腺癌發(fā)病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 胰腺癌(Pancreatic Cancer, PC)是一種惡性程度很高的腫瘤，其發(fā)病率在國內(nèi)外均呈上升趨勢(shì)。因其解剖位置特殊，發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚，且侵襲性強(qiáng)、惡性程度高、手術(shù)切除率低、易產(chǎn)生化療耐藥性，故預(yù)后差，死亡率極高。因此，了解胰腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找新的早期診斷方法和有效治療手段是目前的當(dāng)務(wù)之急。
　　 隨著miRNAs的發(fā)現(xiàn)，作為一類在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中發(fā)揮功能的非編碼小RNAs，由于它強(qiáng)大且

2、廣泛的調(diào)控作用，已成為生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。目前研究認(rèn)為，miRNAs可通過類似癌基因、抑癌基因或其他方式調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程。腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞miRNA表達(dá)譜具有明顯差異，且多數(shù)miRNA基因都位于腫瘤形成相關(guān)的脆弱基因位點(diǎn)，miRNA基因高頻率地出現(xiàn)在這些與腫瘤密切相關(guān)的易變基因組中，提示miRNA在腫瘤形成過程中可能扮演著重要的角色。
　　 近年研究顯示，miR-150在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，既有上調(diào)

3、發(fā)揮癌基因作用的報(bào)道，也有下調(diào)發(fā)揮抑癌基因作用的報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，miR-150在胃癌、骨肉瘤、結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移、成釉質(zhì)型顱咽管瘤、肝母細(xì)胞瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、眼結(jié)膜黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等腫瘤中均存在高表達(dá)，充當(dāng)癌基因的作用。而在其他一些腫瘤，包括套細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、結(jié)直腸癌、兒童急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性粒細(xì)胞性白血病、NK/T細(xì)胞淋巴瘤等組織中低表達(dá)，充當(dāng)抑癌基因的功能。為何在不同腫瘤中會(huì)出現(xiàn)這種截然相反的結(jié)果，目前

4、尚不清楚。分析其作用機(jī)制，現(xiàn)已證實(shí)的miR-150的作用靶點(diǎn)有核轉(zhuǎn)錄因子c-Myb、4型黏蛋白(mucin4，MUC4)、早期生長應(yīng)答因子2（early growth response factor2，EGR2）、角化不良蛋白1（dyskerin1，DKC1）和蛋白激酶B2(protein kinase B2，PKB2)等，其中，c-Myb是miR-150相對(duì)明確的一個(gè)進(jìn)化保守的作用靶點(diǎn)，乳腺癌細(xì)胞和白血病細(xì)胞中miR-150的異常表達(dá)

5、在信使RNA(mRNA)和蛋白水平上均可抑制內(nèi)生性的c-Myb，在一些白血病細(xì)胞系、原發(fā)性白血病細(xì)胞和正常淋巴細(xì)胞中miR-150的表達(dá)水平均與c-Myb呈相反的關(guān)系。Zhang等也證實(shí)miR-150與c-Myb mRNA的3'UTR相互作用，miR-150的過表達(dá)可下調(diào)c-Myb的蛋白水平，并且可導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子cyclin D1和細(xì)胞生成調(diào)節(jié)因子Bcl-2的減少。另有研究顯示，在腫瘤組織中miR-150表達(dá)與MUC4的表達(dá)呈負(fù)相

6、關(guān)性。我們前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)c-Myb、MUC4和miR-150的表達(dá)在胰腺癌及癌旁組織中均存在明顯差異。由此我們初步推斷在胰腺癌中miR-150可能通過作用于c-Myb和MUC4這兩種靶蛋白來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
　　 對(duì)于miR-150與胰腺癌之間關(guān)系的研究目前國內(nèi)外均鮮有報(bào)道。因此本研究旨在探討miR-150在胰腺癌組織中的表達(dá)及意義，并研究其調(diào)控c-Myb和MUC4的表達(dá)在胰腺癌發(fā)病中的作用及其與胰腺癌臨床病理指標(biāo)及預(yù)后間的相

7、關(guān)性。
　　 材料與方法:
　　 1.分別采用原位雜交和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)106例胰腺癌組織芯片中miR-150及其靶蛋白c-Myb和MUC4在胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)，并分析它們間的相互關(guān)系，以及與胰腺癌臨床病理學(xué)指標(biāo)和預(yù)后間的相關(guān)性;
　　 2.應(yīng)用miR-150慢病毒載體并感染胰腺癌細(xì)胞株，通過測(cè)定細(xì)胞生長、平板克隆、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和侵襲遷移等實(shí)驗(yàn)探討miR-150對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;

8、>　　 3.采用裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討miR-150過表達(dá)對(duì)胰腺癌生物學(xué)行為的影響，并分析其在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1.miR-150在胰腺癌組織中較癌旁表達(dá)降低，c-Myb和MUC4則在癌組織中較癌旁組織中表達(dá)升高;miR-150、c-Myb和MUC4的表達(dá)與胰腺癌患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)指標(biāo)間沒有

9、顯著的相關(guān)性;但miR-150高表達(dá)的胰腺癌患者的生存期較低表達(dá)者長，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而c-Myb和MUC4低表達(dá)的胰腺癌患者的生存期較高表達(dá)者有延長的趨勢(shì);
　　 2.細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-150過表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且影響細(xì)胞周期的改變，使細(xì)胞阻滯于G1期;在胰腺癌細(xì)胞中miR-150的表達(dá)量與c-Myb和MUC4呈負(fù)相關(guān):升高胰腺癌細(xì)胞中miR-150的表達(dá)量時(shí)，

10、c-Myb和MUC4的表達(dá)量均降低，相反，降低胰腺癌細(xì)胞中miR-150的表達(dá)量時(shí)，c-Myb和MUC4的表達(dá)量相應(yīng)升高;
　　 3.高表達(dá)miR-150，能抑制胰腺癌細(xì)胞株在裸鼠體內(nèi)成瘤，相反，抑制miR-150表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞株在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力明顯高于對(duì)照組;上述成瘤組織中c-Myb和MUC4的表達(dá)與miR-150呈負(fù)性相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.miR-150在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁組

11、織，提示其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中可能起負(fù)性調(diào)節(jié)作用;
　　 2.細(xì)胞學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，miR-150對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、克隆形成、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為起明顯的抑制作用，提示其可能作為抑癌基因發(fā)揮作用;
　　 3.在胰腺癌中miR-150作用的靶蛋白是c-Myb和MUC4，miR-150是通過抑制c-Myb和MUC4的表達(dá)發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用的;
　　 4.臨床大樣本胰腺癌病例驗(yàn)證顯示，miR-150的表達(dá)與胰腺癌患者