TMEM45B在胰腺癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡中的機(jī)制研究.pdf_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:胰腺癌(pancreatic cancer)是一種死亡率極高的惡性消化道腫瘤。因患者被診斷時(shí)往往已經(jīng)處于晚期,甚至大部分患者已發(fā)生鄰近器官的浸潤(rùn)或是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,從而喪失了最佳治療時(shí)機(jī)而致其5年生存期低于6%。因此胰腺癌的早期診斷對(duì)其采取相應(yīng)的治療方案有著決定性的意義。腫瘤細(xì)胞的生成源于正常細(xì)胞的不規(guī)則生長(zhǎng),其與腫瘤基因的激活和抑瘤基因的失活有著密切的關(guān)系。但是鑒于影響胰腺癌的因素眾多,涉及的一系列的腫瘤基因、抑瘤基因和信號(hào)通路使得胰

2、腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍不甚明了。在以往諸多報(bào)道中TMEM(transmembrane proteins)家族成員與各種腫瘤的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。而最近興起的TMEM家族中 TMEM45B與腫瘤的相關(guān)報(bào)道至今仍未見報(bào)道。因此本研究擬通過對(duì)中TMEM45B基因與胰腺癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡予以探討,旨在了解TMEM45B在胰腺癌進(jìn)程中發(fā)揮的作用及機(jī)制,為胰腺癌的相關(guān)診療工作提供新思路。
  方法:在前期研究工作中,我們發(fā)現(xiàn) TMEM4

3、5B與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。因此本研究收集了2005~2013年45例經(jīng)病理學(xué)鑒定的外科手術(shù)切離的胰腺癌組織及癌旁組織標(biāo)本,并使用qRT-PCR和免疫組化對(duì)45例組織中TMEM45B基因的表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行鑒定和檢測(cè)。同時(shí)本研究還以胰腺癌5種細(xì)胞系(BxPC-3、CFPAC-1、SW1990、Capan-1、和PANC-1)和一種正常胰腺細(xì)胞系HPDE6-C7為對(duì)象使用qRT-PCR和WB進(jìn)行mRNA和蛋白水平的檢測(cè),并隨后以高表

4、達(dá)TMEM45B的兩種細(xì)胞系(SW1990和PANC-1)進(jìn)行后續(xù)功能研究實(shí)驗(yàn)的實(shí)施對(duì)象。為了進(jìn)一步研究 TMEM45B在腫瘤進(jìn)程中的功能,本研究使用基因富集分析技術(shù)(Gene set enrichment analysis,GSEA)對(duì)TMEM45Bhigh和TMEM45Blow細(xì)胞系與細(xì)胞周期相關(guān)基因和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的相關(guān)性進(jìn)行分析。為了進(jìn)一步證明TMEM45B對(duì)細(xì)胞周期和腫瘤轉(zhuǎn)移的影響,本研究選用SW1990和 PANC-1兩種

5、細(xì)胞系,并設(shè)計(jì)pLKO.1-C1/sh-TMEM45B進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,并對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白中的3個(gè)核心蛋白(PCNA、CDK1和 CDC25A)以及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白中的3個(gè)核心蛋白(RAB1A、MAP4K3和NME2)行WB檢測(cè),并對(duì)其基因表達(dá)水平行qRT-PCR檢測(cè)。為了證明TMEM45B基因?qū)υ鲋车挠绊?,本研究分別通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估:1)對(duì)SW1990和PANC-1兩種細(xì)胞系轉(zhuǎn)染sh-TMEM45B,在隨后的24h、48h和72h

6、通過對(duì)細(xì)胞相對(duì)數(shù)量的檢測(cè)進(jìn)行評(píng)估;2)本研究為了較為明顯的觀察腫瘤生長(zhǎng)狀況,選用了增殖速度較快的細(xì)胞系SW1990同時(shí)并構(gòu)建了相應(yīng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,并以此細(xì)胞系接種裸鼠,12d后觀察并測(cè)量腫瘤組織體積大小及重量。為驗(yàn)證 TMEM45B對(duì)細(xì)胞周期的影響,本研究分別轉(zhuǎn)染sh-TMEM45B入SW1990和PANC-1細(xì)胞系,并通過流式細(xì)胞術(shù)分析TMEM45B對(duì)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。同時(shí)我們還使用transwell對(duì)侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)行檢測(cè)。<

7、br>  結(jié)果:本研究通過對(duì)45例胰腺癌的臨床組織標(biāo)本行免疫組化和WB檢測(cè),結(jié)果也驗(yàn)證了 TMEM45B在胰腺癌組織中其 mRNA和蛋白水平均顯著高于癌旁組織(P<0.01)。與此同時(shí)我們還對(duì)5種細(xì)胞系(BxPC-3、CFPAC-1、SW1990、Capan-1和PANC-1)和一種正常胰腺細(xì)胞系HPDE6-C7為對(duì)象進(jìn)行mRNA和蛋白水平的檢測(cè),結(jié)果顯示SW1990和PANC-1兩種細(xì)胞系TMEM45B表達(dá)水平較高,遂入選并作為后期的

8、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。為進(jìn)一步研究TMEM45B在腫瘤中的作用,本研究成功設(shè)計(jì)了pLKO.1-C1/sh-TMEM45B,并使用GSEA手段分析TMEM45B與腫瘤細(xì)胞周期及轉(zhuǎn)移直接相關(guān)。隨后,我們通過sh-TMEM45B干擾TMEM45B表達(dá),并對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)的核心蛋白及轉(zhuǎn)移相關(guān)核心蛋白進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示干擾后核心蛋白相對(duì)含量均較干擾前顯著下降(P<0.01);在TMEM45B對(duì)細(xì)胞增殖的研究數(shù)據(jù)顯示,兩種細(xì)胞系中sh-TMEM45B干擾組體外細(xì)

9、胞增殖水平在24h、48h以及72h均顯著低于同一時(shí)間點(diǎn)的未處理組(P<0.01),體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)同樣顯示,干擾組裸鼠腫瘤組織體積及重量顯著小于未處理組(P<0.01);而細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞系的sh-TMEM45B干擾組其G1期細(xì)胞比例較未處理組顯著升高(P<0.01),而S期比例顯著下降(P<0.01),對(duì)G2期無明顯影響,而過表達(dá)TMEM45B組,其G1、S1和 G2較未處理組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);sh-TMEM45

10、B干擾能夠顯著的增加細(xì)胞的凋亡,而過表達(dá)使得細(xì)胞凋亡減少,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示其對(duì)早期凋亡的影響尤為顯著(P<0.01),并且WB初步證明其凋亡與Bax和Caspase3蛋白高表達(dá)相關(guān)。同時(shí)對(duì)TMEM45B在侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用研究發(fā)現(xiàn),其表達(dá)降低侵襲性也隨之降低,表達(dá)升高其侵襲性也隨之升高。反之,本研究選擇 TMEM45B表達(dá)水平較低的CFPAC-1細(xì)胞系,并使用慢病毒使CFPAC-1高表達(dá)TMEM45B,隨之對(duì)細(xì)胞系增殖能力、侵襲能力、抗凋亡

11、能力及細(xì)胞周期進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,過表達(dá) TMEM45B的CFPAC-1細(xì)胞其增殖能力在24h、48h、72h時(shí)均顯著高于對(duì)照組;同時(shí)過表達(dá)TMEM45B組其凋亡比例顯著低于對(duì)照組;transwell實(shí)驗(yàn)亦證明了過表達(dá)TMEM45B使得胰腺癌細(xì)胞侵襲力顯著提升;同樣 TMEM45B也影響 CFPAC-1細(xì)胞周期,即G1期細(xì)胞比例降低,S期細(xì)胞比例升高。
  結(jié)論: TMEM45B作為一種膜蛋白分子,其通過影響細(xì)胞周期及轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白

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