自由流電泳進樣技術及其應用的研究.pdf

1、第1頁申請上海交通大學博士學位論文自由流電泳進樣技術及其應用的研究自由流電泳進樣技術及其應用的研究學校：學校：上海交通大學院系：院系：生命科學技術學院班級：級：A0708092學號：號：0070809051博士生：博士生：邵菁專業(yè)：專業(yè)：生物學導師：導師：曹成喜(教授)上海交通大學生命科學技術學院上海交通大學生命科學技術學院2012年5月上海交通大學博士學位論文摘要第5頁摘要摘要自由流電泳(FreeFlowElectrophesisFF

2、E)是一種兼具制備和分析功能的純液相電泳，具有反應過程可控、條件溫和、回收率較高、分辨率良好、生物活性保持完好且應用廣泛等優(yōu)點。FFE發(fā)展至今，主要的研究重點和難點是如何在縮窄樣品帶寬，改善分辨率的同時增加通量。目前的解決方法主要是：(1)減小樣品的初始帶寬；(2)改變FFE的運行模式(如間斷式FFE的引入)；(3)使用聚焦的方式(如IEF)。但是相關的研究卻存在一些問題：(1)減小樣品的初始帶寬會導致通量的損失，使FFE失去制備的意義

3、；(2)至今沒有闡明間斷式FFE模式與連續(xù)式FFE模式相比能否在相同通量條件下具有更好的分辨率；(3)聚焦不僅需要大量的兩性電解質(zhì)，使得分離制備成本大幅上漲，而且兩性物質(zhì)(如蛋白質(zhì))在聚焦位置(即等電點處)溶解度大幅下降，使樣品易損失。基于前兩個問題，本文做了一些樣品帶寬控制方面的初步研究。在開展實驗之前，我們對已經(jīng)搭建的重力自平衡自由流電泳裝置做了一系列改進，包括：(1)更換自平衡收集器的材質(zhì)；(2)電極室縮短；(3)減小收集導管死體

4、積；(4)加厚分離腔上下板；(5)在分離腔上板設置冷卻擋板。經(jīng)過改進后的整個裝置占地空間由原來的80cm100cm160cm縮小為現(xiàn)在的70cm85cm45cm。本文中，我們開展了如下一系列實驗工作：(1)研究如何利用樣品背景流量之比控制樣品帶寬、分辨率和載量。這里我們選用了兩種進樣方式；其一為保持背景緩沖液流量不變，改變樣品進樣流量；其二為保持樣品進樣流量不變，改變背景緩沖液流量。利用含有結晶紫的商品化甲基綠染料作為可視化樣本，我們發(fā)

5、現(xiàn)通過調(diào)節(jié)樣品和背景緩沖液流量的比率可以很好的控制混合染料(甲基綠與結晶紫)的帶寬、分辨率和通量。這些結果對于今后FFE裝置的設計有著極為重要的意義。(2)在相同通量的情況下，定量比較間斷式FFZE和連續(xù)式FFZE在分辨率提高方面的差異。實驗中，我們?nèi)匀徊捎昧撕薪Y晶紫的商品化甲基綠染料作為可視化樣本，同時嚴格控制了4個實驗參數(shù)，即相同的模式染料載量(3.49、1.75、1.17、0.88mgh)，相同的運行時間(5、10、15、20m