新型微型自由流電泳裝置的研制及其在制備豬胰蛋白酶的應(yīng)用.pdf

1、自由流電泳是一種基于連續(xù)化電泳技術(shù)發(fā)張的在兩個(gè)平行板直接利用連續(xù)的液相環(huán)境分離生物樣品的技術(shù)。在垂直于背景緩沖的電場(chǎng)作用下，物質(zhì)根據(jù)電泳淌度不同得到分離。四種不同的自由流技術(shù)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出來(lái)。其中包括自由流區(qū)帶電泳、自由流等速電泳、自由流等電聚焦電泳和自由流場(chǎng)梯度電泳。由于商業(yè)自由流設(shè)備相對(duì)大的尺寸，至今很少有商業(yè)化設(shè)備用于生物樣品的微制備。在四種自由流的分離模式中（FFZE、FFIEF、FFFSE、FFITP)，自由流區(qū)帶電泳是在商

2、業(yè)化大型自由流設(shè)備中一種用于酶分離最常用的分離模式。有文獻(xiàn)報(bào)道了其細(xì)節(jié)但是這些報(bào)道都是用于大量的商業(yè)制備而不是對(duì)酶在微型自由流設(shè)備下的微量制備。
　　芯片電泳在近20年內(nèi)在分離科學(xué)領(lǐng)域得到了很高的重視。然而由于其相對(duì)薄弱的制備能力和易于被蛋白沉淀堵塞，很少有報(bào)告報(bào)道其在生物樣品的微制備。對(duì)于在芯片電泳中，微量制備酶就更少了。
　　為了滿足實(shí)驗(yàn)室對(duì)生物樣品的微量制備的急切需求，我們研制了一種微型的電泳。其尺寸為45 mm×30

3、 mm×100-500μm比芯片電泳(20-40 mm×20-56 mm×20-60μm)要大但比商業(yè)化的制備電泳要小的多。在這個(gè)自由流設(shè)備中，重力和一個(gè)16通道的蠕動(dòng)泵成功的在分離室里形成了個(gè)穩(wěn)定的層流，并且完成了16管樣品的引流。一個(gè)常用于醫(yī)學(xué)的簡(jiǎn)易上樣閥被很好的利用在控制帶寬上。在這個(gè)微型自由流中，重力選用的模式是和過(guò)去本實(shí)驗(yàn)室研制的大型自由流有明顯不同。這種微型自由流被用于從豬的粗胰酶中微量制備極易失活的胰蛋白酶。分離效果取決于

4、緩沖液的pH和電導(dǎo)，樣品在分離室的保留時(shí)間，流速和所加電壓。在初步優(yōu)化下得到，純化因子為11.68，酶比活達(dá)到了商業(yè)級(jí)別(6236BAEE U/mg)，產(chǎn)率是58％，同時(shí)其分離大約20μL樣品的保留時(shí)間僅為48秒而且在其產(chǎn)量達(dá)到每小時(shí)3.34mg都表明其快速的微量制備能力。據(jù)我們所致，這是第一臺(tái)用于微量酶制備的微型自由流設(shè)備。其在分離過(guò)程中表現(xiàn)出以下優(yōu)勢(shì)：
　?。?）在這個(gè)微型自由流分離室里，沒(méi)有出現(xiàn)很強(qiáng)電動(dòng)力干擾同時(shí)也沒(méi)有出現(xiàn)由