P物質(zhì)及其N(xiāo)K-1受體參與大鼠外周傷害性信息傳入引起的脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活.pdf

1、目的:近年來(lái)，隨著對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞功能研究的深入，其在外周神經(jīng)損傷及炎癥誘發(fā)的病理性痛中的作用越來(lái)越受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，在外周神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性痛模型中或福爾馬林、角叉菜膠等引起的炎性痛模型中，均伴有脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活?；罨せ畹男∧z質(zhì)細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生和釋放多種促炎細(xì)胞因子如白介素-1β，腫瘤壞死因子-α等，上調(diào)表達(dá)多種活性蛋白或受體，如補(bǔ)體受體CD4、C3、CX3CR1，ATP受體P2X(4)等，直接或間接作用于痛覺(jué)傳

2、遞神經(jīng)元，使其敏化，參與病理性痛及痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生與維持。而給予小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑米諾環(huán)素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活后，可顯著抑制病理性痛及痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生。以上研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活在病理性痛及痛覺(jué)過(guò)敏的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要作用。但在這一過(guò)程中，小膠質(zhì)細(xì)胞激活的具體機(jī)制尚不完全清楚。
　　P物質(zhì)(Substance P，SP)是脊髓內(nèi)重要的神經(jīng)激肽類(lèi)遞質(zhì)，被認(rèn)為是痛覺(jué)傳遞的重要信使。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，SP主要存在于脊髓Ⅱ板層初級(jí)傳入纖維（C

3、類(lèi)纖維）末梢中。它的受體神經(jīng)激肽-1(neurokinin-1，NK-1)受體主要分布在脊髓后角Ⅰ板層神經(jīng)元的樹(shù)突和胞體上。SP通過(guò)與其N(xiāo)K-1受體結(jié)合發(fā)揮作用，參與脊髓傷害性信息的傳遞。但是近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，除了初級(jí)傳入末梢外，人胚和鼠類(lèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞也可以釋放大量的SP。同時(shí)，除了介導(dǎo)痛覺(jué)傳遞的二級(jí)神經(jīng)元胞體外，人胚和鼠類(lèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞上也表達(dá)著有功能的NK-1受體。因此，傷害性信息傳入時(shí)，引起SP釋放也可能通過(guò)膠質(zhì)細(xì)胞膜上的NK-1受

4、體參與脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察應(yīng)用NK-1受體拮抗劑L-732，138對(duì)大鼠蜜蜂毒(bee venom，BV)炎性痛及痛過(guò)敏時(shí)脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b/c(OX-42)表達(dá)的影響，探討SP及其N(xiāo)K-1受體在外周傷害性信息傳入引起的脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞激活中的作用。
　　方法:雄性Sprague-Dawley大鼠84只，體重250-280 g，隨機(jī)分為以下5組:
　?、賁ham組(n=24):于

5、正常大鼠右后足底皮下注射生理鹽水50μl。
　?、诿鄯涠窘M(n=24):于大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液(4g/L)50μl。
　?、勖鄯涠?L-732，138組(n=12):給大鼠椎管內(nèi)注射10μl NK-1受體拮抗劑L-732，138(200 nmol)，15min后于大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液(4g/L)50μl。
　?、苊鄯涠?DMSO組(n=12):給大鼠椎管內(nèi)注射10μl80％DMSO（L-732，13

6、8的溶劑），15 min后于大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液(4g/L)50μl。
　　⑤Sham+L-732，138組(n=12):給大鼠椎管內(nèi)注射10μl NK-1受體拮抗劑L-732，138（200 nmol），15 min后于大鼠右后足底皮下注射50μl生理鹽水。
　　各組大鼠于足底注射生理鹽水或蜜蜂毒溶液后即刻計(jì)數(shù)1h內(nèi)自發(fā)縮足次數(shù)，觀察其自發(fā)痛反應(yīng)變化;并于足底注射前1d、注射后1d、3d、7d測(cè)定熱縮足反射潛伏期

7、及機(jī)械縮足反射閾值的變化;Sham組與蜜蜂毒組于足底注射后1h、1d、3d、7d取材，其余各組于足底注射后3d取材，冰凍連續(xù)切片，應(yīng)用免疫組化法觀察L5節(jié)段脊髓后角CD11b/c(OX-42)蛋白的表達(dá)，以觀察脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1 NK-1受體拮抗劑L-732，138減輕足底注射蜜蜂毒大鼠的自發(fā)痛及痛過(guò)敏反應(yīng)
　　1.1自發(fā)痛行為反應(yīng)
　　足底注射生理鹽水后，大鼠不產(chǎn)生自發(fā)痛行為，而

8、足底注射蜜蜂毒后，大鼠出現(xiàn)明顯的自發(fā)痛行為，表現(xiàn)為緊張性的舔，咬和劇烈抖動(dòng)注射足，注射足抬高，不持重或持重減輕等行為，自發(fā)痛反應(yīng)評(píng)分顯著增加(P＜0.05)。與蜜蜂毒組相比，椎管內(nèi)預(yù)先注射L-732，138后，大鼠的自發(fā)痛行為反應(yīng)有所減輕，自發(fā)痛反應(yīng)評(píng)分顯著降低（P＜0.05）;而椎管內(nèi)預(yù)先注射DMSO對(duì)注射蜜蜂毒引起的自發(fā)痛行為無(wú)顯著影響。椎管內(nèi)注射L-732，138不會(huì)引起sham組大鼠的自發(fā)痛行為。
　　1.2熱縮足反射潛伏

9、期和機(jī)械縮足反射閾值
　　與注射前相比，足底注射生理鹽水（sham組）后1d、3d和7d，大鼠注射足的熱縮足反射潛伏期和機(jī)械縮足反射閾值無(wú)顯著變化。足底注射蜜蜂毒后，上述各時(shí)間點(diǎn)大鼠注射足的熱縮足反射潛伏期和機(jī)械縮足反射閾值均較sham顯著降低(P＜0.05)，其中以注射后1d降低最為顯著，3d、7d逐漸回升，表明足底注射蜜蜂毒誘發(fā)大鼠產(chǎn)生了熱和機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏。椎管內(nèi)預(yù)先注射L-732，138可顯著抑制注射蜜蜂毒大鼠熱縮足反射潛伏

10、期和機(jī)械縮足反射閾值的下降(P＜0.05);而椎管內(nèi)預(yù)先注射DMSO對(duì)注射蜜蜂毒大鼠的熱縮足反射潛伏期和機(jī)械縮足反射閾值無(wú)顯著影響。椎管內(nèi)注射L-732，138對(duì)sham組大鼠的熱縮足反射潛伏期和機(jī)械縮足反射閾值無(wú)顯著影響。
　　2 NK-1受體拮抗劑L-732，138抑制蜜蜂毒炎性痛大鼠脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活
　　免疫組化染色結(jié)果顯示，CD11b/c(OX-42)在sham組大鼠L5節(jié)段脊髓后角有一定量的基礎(chǔ)表達(dá)，免疫反

11、應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞較少，胞體較小，突起較細(xì)，散在分部于脊髓后角。大鼠足底注射蜜蜂毒1h后，脊髓后角免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞未見(jiàn)明顯變化;注射后1d時(shí)，免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，胞體增大，突起變粗，免疫染色積分光密度值顯著增大（P＜0.05）;注射后3d時(shí)，CD11b/c(OX-42)表達(dá)達(dá)到高峰;注射后7d時(shí)，雖然CD11b/c（OX-42）陽(yáng)性表達(dá)水平仍較高，但較3d時(shí)有所減少。以上結(jié)果表明，脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞在蜜蜂毒炎性痛模型中受到炎性刺激后1d開(kāi)

12、始激活，3d時(shí)激活達(dá)到高峰，7d時(shí)開(kāi)始減弱。
　　在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇小膠質(zhì)細(xì)胞激活最明顯的3d時(shí)間點(diǎn)，觀察NK-1受體拮抗劑L-732，138對(duì)蜜蜂毒炎性痛大鼠脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，預(yù)先椎管內(nèi)給予NK-1受體拮抗劑L-732，138后，可顯著抑制蜜蜂毒引起的大鼠脊髓后角CD11b/c(OX-42)表達(dá)的上調(diào)，表現(xiàn)為免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，胞體縮小，突起變細(xì)，免疫染色積分光密度值顯著降低(P＜0.05)。表明N

13、K-1受體拮抗劑L-732，138抑制了蜜蜂毒引起的大鼠脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。
　　結(jié)論:
　　1、大鼠足底注射蜜蜂毒可引起大鼠自發(fā)痛反應(yīng)及熱和機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏，同時(shí)引起大鼠脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。
　　2、NK-1受體拮抗劑L-732，138可顯著抑制蜜蜂毒引起的大鼠脊髓后角小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，同時(shí)可減輕蜜蜂毒引起的大鼠自發(fā)痛反應(yīng)及熱和機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏。
　　3、上述結(jié)果提示，SP及其N(xiāo)K-1受體參與傷害性信息