傷害性感受器NK-1受體的激活增強TRPV1和TTX不敏感鈉通道活動的機制研究.pdf

1、背根節(jié)介導傷害性信息的初級感覺神經元的外周終末，稱為“傷害性感受器”或“痛覺感受器”。傷害性感受器將傷害性刺激換能，轉變成神經沖動，傳遞到脊髓背角，經初步整合傳遞到大腦進行信息加工，最終產生痛覺。背根節(jié)中的傷害性感覺神經元作為痛覺傳導的第一級神經元，在痛覺產生和維持中發(fā)揮重要的作用。 P物質(SP)是速激肽家族的主要成員，在神經系統(tǒng)廣泛表達。在外周神經系統(tǒng)中，主要存在傷害性感覺神經元上，是外周傷害性傳入信息向脊髓背角神經元傳遞的

2、主要信使之一。SP在背根節(jié)神經元胞體合成，雙向地輸送到傷害性感覺神經元的中樞末梢和外周末梢，包含在大的致密的囊泡中。在中樞端的脊髓背角，SP陽性的神經末梢與背角Ⅰ層的投射神經元連接，傳遞傷害性信息；而在外周神經末梢，傷害性感受器的SP作為炎癥因子之一，釋放到外周，激活肥大細胞，產生外周敏化機制。速激肽家族有三種受體：NK-1、NK-2和NK-3，其中SP對NK-1的親和力最高，因此，NK-1被公認為SP受體。 SP作為脊髓傷害性

3、初級傳入信使，在行為、細胞和分子水平已進行了深入的研究。如外周傷害性刺激引起SP在脊髓背角淺層釋放；脊髓施加NK-1激動劑和拮抗劑，可分別增強和抑制脊髓背角痛敏神經元活動、傷害性反射和Fos表達；NK-1或者SP基因敲除的動物，急性痛不受影響，但是慢性痛的形成過程大大減慢。但是關于SP參與外周敏化的機制以及細胞內信號通路卻知之甚少。本實驗室以前的工作表明，含有SP的背根節(jié)神經元可能表達NK-1自身受體；SP引起外周的熱痛覺過敏，而這一過

4、程與表達NK-1的肥大細胞沒有關系。本論文應用免疫組織化學、蛋白免疫印跡、全細胞膜片鉗以及鈣成像等多種技術，對NK-1自身受體的存在、NK-1對介導熱痛敏的辣椒素受體TRPV1和TTX不敏感鈉通道的調制，以及可能的作用機制進行了研究。 一.形態(tài)學觀察 背根神經節(jié)細胞上存在NK-1受體。該受體合成后被運輸到外周神經末梢，在完全福氏佐劑致炎2天之后，表達量明顯升高。同時在DRG小細胞上存在一定比例NK-1與SP雙標神經元和N

5、K-1與TRPV1雙標的神經元。 二.SP對TRPV1的調制 1.SP增強TRPV1活動 TRPV1受體是一個非選擇性的陽離子通道，在全細胞膜片鉗和鈣成像試驗中，TRPV1受體特異的激動劑辣椒素分別引起細胞的內向電流以及胞內鈣離子濃度的瞬時升高，而SP均能夠引起TRPV1反應的增強。75.8％的背根神經節(jié)小細胞(直徑＜25μM)對辣椒素有反應。其中在49.6％的辣椒素反應陽性神經元中，SP對辣椒素反應有增強作用(

6、409.12±44.54％)。NK-1受體的激動劑[Sar9，Met(O2)11]SP(Sar-SP，1μM)能夠模擬SP的作用；NK-1特異性的拮抗劑GR82，334(1μM)和WIN58，078(5μM)能夠特異性的抑制SP引起的反應，而NK-2和NK-3的拮抗劑L659，187(1μM)和SR-142，801(1μM)不影響SP引起的增強作用，提示SP特異的通過NK-1受體調節(jié)TRPV1受體的功能。 2.信號轉導機制分析

7、 G蛋白特異拮抗劑GDP-β-s(1 mM，胞內)、PKC的抑制劑BIM(1μM)和CheL.C(1μM)以及PKCε亞型的特異拮抗劑εV1-2(200μM，胞內)也特異性的抑制SP引起的反應，PKC的激活劑PMA(0.6μM)能夠模擬SP引起辣椒素反應的增大；PKA的拮抗劑H89(1μM)以及細胞內鈣的螯合劑BEPTA不能抑制SP引起的辣椒素反應的增強。以上結果提示SP在外周神經末梢激活G蛋白偶聯的NK-1受體，激活PKC的亞型

8、PKCε，從而磷酸化TRPV1受體，產生熱痛覺過敏的作用。 三.SP調制TTX不敏感鈉通道 TTX不敏感的鈉通道包含兩種亞型Nav1.8和Nav1.9，兩者根據電流性質的不同，分別參與動作電位的產生和靜息膜電位的維持。我們采用全細胞膜片鉗的方法，使用不同的電壓刺激方法，成功分離了兩種亞型鈉離子通道的電流。 1.Nav1.8 在78.3％(22/28)的背根神經節(jié)小細胞上能夠記錄到Nav1.8介導的高閾值激

9、活的鈉電流，其中在40.9％(9/22)的Nav1.8陽性反應細胞中，特異性NK-1的激動劑Sar-SP(1μM)顯著性的增強Nav1.8亞型鈉通道介導的電流(123.52±2.83％)；且Sar-SP使Nav1.8亞型鈉通道的激活和穩(wěn)態(tài)失活曲線向超極化方向移動。 2.Nav1.9 在62.6％(20/32)背根神經節(jié)小細胞上能夠記錄到低閾值激活的不失活的Nav1.9介導的鈉電流，在35％(7/20)的Nav1.9陽性反

10、應細胞上，Sar-SP顯著性的增強Nay1.9亞型鈉通道介導的電流(110.27±2.33％)。提示SP通過增強兩種亞型鈉離子通道的敏感性提高傷害性感受器的興奮性。 綜上所述，本論文首次系統(tǒng)的論述了SP通過激活傷害性感受器上的NK-1自身受體，激活細胞內的信號通路，增強傷害性感受器上TRPV1受體和TTX不敏感鈉通道的敏感性，從而產生外周敏化的機制。這項研究不僅揭示了新的外周敏化的機制，也為我們進一步了解炎癥過程中的痛覺過敏的產