β-catenin蛋白調節(jié)機制的研究.pdf

1、為了進一步深入研究β-catenin的調節(jié)機制,并闡述其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用,該研究中,我們選擇兩個基因作為主要研究對象:(1)通過對人FRAT1基因功能和與食管癌關系的研究,探討β-catenin蛋白在食管癌中異常累積的機制;(2)以PCP-2基因為研究對象,探討酪氨酸磷酸酶對β-catenin蛋白功能的負調節(jié)作用.首先,我們構建了人FRAT1基因的原核和真核表達載體,并使其攜帶外源標簽HA.經DNA測序,與GeneBank中比較,

2、證明序列基本一致.FRAT1基因在原核系統(tǒng)中不能誘導表達融合蛋白,這也是Wnt通路其它成員中的常見問題.而FRAT1的真核表達載體能夠在293細胞中正確表達,利用抗外源標簽HA的抗體進行檢測,在預期的位置有特異性的條帶.經G418篩選,獲得穩(wěn)定細胞株293/FRAT1,為今后的功能研究提供了良好的細胞模型.進一步探討FRAT1促進細胞轉化的分子機制,結果表明,FRAT1能夠促進β-catenin蛋白在細胞漿和細胞核內的累積,同時使細胞內

3、游離狀態(tài)的β-catenin蛋白水平提高.報告基因實驗顯示,FRAT1的過表達可以激活β-catenin/TCF依賴的轉錄.Western Blot結果表明,FRAT1可以引起Wnt/β-catenin通路的靶基因c-myc、survivin、cox-2和Id2的上調,而且上調依賴于β-catenin的轉錄活性.為了探討酪氨酸磷酸酶對β-catenin的負調節(jié)作用,我們選擇受體型酪氨酸磷酸酶PCP-2作為研究對象.首先通過免疫共沉淀的方

4、法,證明PCP-2通過其胞內區(qū)(近膜區(qū)和兩個磷酸酶活性區(qū))與β-catenin蛋白相互作用.經典的Top/Fop Flash報告基因實驗顯示,PCP-2的全長和PCP-2胞內區(qū)對于野生型和突變型β-catenin引起的轉錄激活均具有抑制作用,并且還可以抑制β-catenin/TCF激活的靶基因的蛋白表達.將PCP-2的兩個磷酸酶活性區(qū)突變后,這種抑制作用就消失了,提示PCP-2對β-catenin蛋白轉錄活性的調節(jié)可能依賴于酪氨酸磷酸酶

5、活性,通過影響β-catenin蛋白的酪氨酸磷酸化水平發(fā)揮作用.綜上所述,該實驗從兩個方面探討了β-catenin的調節(jié)機制.FRAT1是已知的Wnt通路的正調節(jié)因子,但是尚無直接結果表明FRAT1對β-catenin蛋白的調節(jié),以及FRAT1在腫瘤中的作用機制.該實驗首次在細胞水平上證明了FRAT1對β-catenin蛋白水平和功能具有正向調節(jié)作用,同時首次提出FRAT1的上調可能是食管鱗癌中β-catenin蛋白異常累積的原因之一,