p120-catenin在臟器損傷中的調節(jié)作用及機制.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 p120在機械通氣肺損傷中的作用及機制
　　實驗一：機械牽張對肺上皮細胞連接的影響及機制
　　目的：
　　課題通過不同機械牽張模式牽張肺上皮細胞(mice lung epithelial cell，MLE-12)，模擬臨床機械通氣肺損傷，探討(1)機械牽張對肺上皮細胞連接蛋白表達及分布的影響(2)明確機械牽張過程中連接蛋白之間的結合狀態(tài)及細胞間隙的形成。(3)通過使

2、用c-Src激酶抑制劑，探討機械牽張引起細胞連接破壞的機制。
　　方法：
　　1.本研究采用FX-4000T Flexercell細胞牽張儀對單層生長小鼠肺上皮細胞株MLE-12進行牽張，20％周期牽張，0.5HZ，牽張2/4h。牽張刺激后檢測以下指標:(1)免疫蛋白印記(western blot)檢測機械牽張對粘附連接蛋白表達量的影響:p120、E-cadherin、occludin、α-catenin、β-catenin

3、。(2)提取細胞膜及細胞漿蛋白，western blot檢測E-cadherin胞膜及胞核分布。(3)免疫共沉淀（CO-Immunoprecipitation，CO-IP）檢測機械牽張肺上皮細胞蛋白間連接變化:p120與E-cadherin，occludin與ZO-1。(4)免疫熒光共聚焦(Immunoflourescence)檢測p120與E-cadherin結合程度及細胞間隙的形成。
　　2.采用c-Src抑制劑PP2（100

4、nM溶于DMSO30μl/ml）預處理MLE-12細胞30 min后，20％的牽張周期牽張2h。(1)western blot檢測c-Src及p-c-Src的活性。(2) western blot檢測p120、occludin表達量。
　　結果：
　　1.機械牽張對連接蛋白及細胞連接的影響:
　　(1)機械牽張對肺上皮細胞連接蛋白的影響。20％機械牽張刺激細胞2h，p120、E-cadherin、occludin、α-

5、catenin表達較基礎值降低，β-catenin表達升高。機械牽張4h后，p120、E-cadherin、occludin、α-catenin水平明顯降低，β-catenin明顯升高。結果顯示除β-catenin外，其它連接蛋白的表達水平隨著牽張時間的延長降解增加，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　(2)機械牽張對E-cadherin分布的影響。機械牽張刺激肺上皮細胞2h、4h后，提取細胞膜及細胞漿蛋白，牽

6、張2h導致細胞膜E-cadherin表達降低，而細胞漿表達增加，4h后與對照組比較，胞膜E-cadherin降低及胞漿增加明顯，E-cadherin胞內吞差異具有顯著意義(p＜0.05)。
　　2.機械牽張激活c-Src激酶，進一步引起p120、occludin降解。
　　(1)機械牽張2h后c-Src活性增加，p-c-Src表達水平增加，但PP2預處理組激酶活性降低，與牽張組比較有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　(

7、2)機械牽張可引起p120、occludin細胞連接蛋白降解，PP2預處理組，細胞連接蛋白降解減少，與牽張組比較有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　結論：
　　1.機械牽張可誘導肺上皮細胞連接蛋白及骨架蛋白的降解:p120、E-cadherin、occludin、α-catenin。
　　2.機械牽張可引起肺上皮細胞E-cadherin胞漿轉運，使E-adherin胞內吞增加。
　　3.機械牽張可促進肺上皮細胞胞

8、漿骨架蛋白的解離，導致肺上皮細胞連接縫隙增加。
　　4.機械牽張肺上皮細胞可激活c-Src激酶，是引起細胞連接蛋白降解、細胞間隙形成的主要原因。
　　5.c-Src抑制劑PP2抑制機械牽張引起的連接蛋白降解及細胞間隙的形成。以上結論表明，機械牽張可通過激活c-Src激酶，進一步引起肺上皮細胞間連接蛋白的降解及解離，從而使細胞間隙增加，肺泡膜通透性增加，是誘導肺水腫發(fā)生的主要因素。而c-Src激酶抑制劑PP2可抑制機械牽張引起

9、的肺水腫，對機械牽張性肺損傷具有保護性作用。
　　實驗二：p120在機械通氣肺損傷中的作用機制
　　目的：
　　本課題通過離體肺上皮細胞周期性牽張和活體小鼠VILI模型，對以下問題進行研究:(1)明確p120對RhoA激酶活性的調節(jié)。(2)明確p120通過調節(jié)RhoA對細胞緊密連接的影響。(3)明確p120在機械通氣肺水腫、肺損傷中的作用及機制。
　　方法：
　　1.本研究采用c-Src抑制劑PP2及Rho

10、A抑制劑Y27632預處理MLE-2，用FX-4000T Flexercell細胞牽張儀對轉染的MLE-12進行牽張，20％周期牽張，0.5HZ，牽張2h。牽張刺激后檢測以下指標:westem blot、免疫熒光共聚焦檢測E-cadherin、occludin表達量及細胞間隙的形成情況。
　　2.采用p120 siRNA/p120 cDNA轉染MLE-12細胞，再用細胞牽張儀對轉染的MLE-12進行牽張，20％周期牽張，0.5HZ

11、，牽張2h。
　　3.將預先配置好的p120 siRNA-liposome混合物注入C57BL/6小鼠眼底靜脈叢，敲除小鼠體內大部分p120基因后進行機械通氣，將小鼠分為正常對照組、高潮氣量機械通氣組、p120基因敲除組、p120基因敲除后高潮氣量機械通氣組（每一組n=5），或小鼠腹腔注射c-Src抑制劑PP2、 RhoA抑制劑Y27632后進行高潮氣量通氣，檢測以下指標:(1) western blot檢測p120脂質體敲除效率

12、。(2)GST pull down assay檢測RhoA活性變化。(3)western blot檢測肺組織E-cadherin、occludin的表達。(4)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測肺泡灌洗液IL-6，TNF-α的生成量。(5)取肺組織稱量濕/干比值（Wet/Dry，W/D）。
　　結果：
　　1.與機械牽張組比較，c-Src抑制劑PP2或Rh

13、oA抑制劑Y27632預處理組可以減少機械牽張引起的E-cadherin及occludin降解。
　　2.(1)機械牽張可以激活RhoA，p120 siRNA處理組RhoA活性增加，機械牽張后，活性明顯增加。
　　(2)采用p120 siRNA轉染MLE-12后進行牽張，p120 siRNA組E-cadherin降解，胞內吞增加，經牽張后胞內吞增加明顯。與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);而p120cDNA轉染組

14、及轉染后機械牽張組E-cadherin降解或胞內吞減少。
　　3.(1)經眼底靜脈叢注射p120 siRNA的小鼠肺組織p120基因敲除70％。
　　(2)經眼底靜脈叢注射p120 siRNA的小鼠肺組織RhoA活性與對照組比較增加。
　　結論：
　　1.c-Src抑制劑PP2或RhoA抑制劑Y27632可以逆轉機械牽張引起的細胞連接蛋白降解、細胞間隙增加。
　　2.p120降解可以激活RhoA激酶活性。<

15、br>　　3.p120 siRNA轉染后可加重E-cadherin內吞，occludin降解，促使occludin與ZO-1解離，細胞間隙增加。但p120過表達組E-cadherin內吞減少，occludin降解減少，occludin與ZO-1、p120與E-cadherin結合增加，細胞間隙修復。
　　第二部分 p120在感染性休克心肌損傷中的作用及機制
　　目的：
　　本課題通過LPS處理離體心肌細胞及心肌細胞株H

16、9c2明確p120在感染性休克過程中對心臟收縮功能的調節(jié)作用及機制。
　　方法：
　　1.本研究采用LPS(1μg/ml)刺激小鼠心肌細胞0、2、4、6h，處理后檢測以下指標:(1)western blot檢測p120表達、PKCα活性;(2) CO-IP檢測p120去磷酸化水平及與N-cadherin之間的關系。
　　2.采用PKCα抑制劑G(o)6976或PKCαsiRNA轉染H9c2細胞或心肌細胞，再用LPS(1

17、μg/ml)處理細胞0、2、4h。
　　結果：
　　1.與對照組比較，LPS處理后心肌細胞p120表達降低，p120去磷酸化增加，PKCα被激活，p120與N-cadherin結合減少，且具有LPS處理的時間依賴性。
　　2.H9c2細胞經PKCα抑制劑及PKCαsiRNA處理后，LPS組較對照組比較p120去磷酸化增加，PKCα被激活，p120與N-cadherin結合減少，心肌細胞間隙增加。而PKCα抑制劑G(o)