p120-catenin在臟器損傷中的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 p120在機(jī)械通氣肺損傷中的作用及機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)一：機(jī)械牽張對(duì)肺上皮細(xì)胞連接的影響及機(jī)制
　　目的：
　　課題通過(guò)不同機(jī)械牽張模式牽張肺上皮細(xì)胞(mice lung epithelial cell，MLE-12)，模擬臨床機(jī)械通氣肺損傷，探討(1)機(jī)械牽張對(duì)肺上皮細(xì)胞連接蛋白表達(dá)及分布的影響(2)明確機(jī)械牽張過(guò)程中連接蛋白之間的結(jié)合狀態(tài)及細(xì)胞間隙的形成。(3)通過(guò)使

2、用c-Src激酶抑制劑，探討機(jī)械牽張引起細(xì)胞連接破壞的機(jī)制。
　　方法：
　　1.本研究采用FX-4000T Flexercell細(xì)胞牽張儀對(duì)單層生長(zhǎng)小鼠肺上皮細(xì)胞株MLE-12進(jìn)行牽張，20％周期牽張，0.5HZ，牽張2/4h。牽張刺激后檢測(cè)以下指標(biāo):(1)免疫蛋白印記(western blot)檢測(cè)機(jī)械牽張對(duì)粘附連接蛋白表達(dá)量的影響:p120、E-cadherin、occludin、α-catenin、β-catenin

3、。(2)提取細(xì)胞膜及細(xì)胞漿蛋白，western blot檢測(cè)E-cadherin胞膜及胞核分布。(3)免疫共沉淀（CO-Immunoprecipitation，CO-IP）檢測(cè)機(jī)械牽張肺上皮細(xì)胞蛋白間連接變化:p120與E-cadherin，occludin與ZO-1。(4)免疫熒光共聚焦(Immunoflourescence)檢測(cè)p120與E-cadherin結(jié)合程度及細(xì)胞間隙的形成。
　　2.采用c-Src抑制劑PP2（100

4、nM溶于DMSO30μl/ml）預(yù)處理MLE-12細(xì)胞30 min后，20％的牽張周期牽張2h。(1)western blot檢測(cè)c-Src及p-c-Src的活性。(2) western blot檢測(cè)p120、occludin表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　　1.機(jī)械牽張對(duì)連接蛋白及細(xì)胞連接的影響:
　　(1)機(jī)械牽張對(duì)肺上皮細(xì)胞連接蛋白的影響。20％機(jī)械牽張刺激細(xì)胞2h，p120、E-cadherin、occludin、α-

5、catenin表達(dá)較基礎(chǔ)值降低，β-catenin表達(dá)升高。機(jī)械牽張4h后，p120、E-cadherin、occludin、α-catenin水平明顯降低，β-catenin明顯升高。結(jié)果顯示除β-catenin外，其它連接蛋白的表達(dá)水平隨著牽張時(shí)間的延長(zhǎng)降解增加，與對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　(2)機(jī)械牽張對(duì)E-cadherin分布的影響。機(jī)械牽張刺激肺上皮細(xì)胞2h、4h后，提取細(xì)胞膜及細(xì)胞漿蛋白，牽

6、張2h導(dǎo)致細(xì)胞膜E-cadherin表達(dá)降低，而細(xì)胞漿表達(dá)增加，4h后與對(duì)照組比較，胞膜E-cadherin降低及胞漿增加明顯，E-cadherin胞內(nèi)吞差異具有顯著意義(p＜0.05)。
　　2.機(jī)械牽張激活c-Src激酶，進(jìn)一步引起p120、occludin降解。
　　(1)機(jī)械牽張2h后c-Src活性增加，p-c-Src表達(dá)水平增加，但PP2預(yù)處理組激酶活性降低，與牽張組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　(

7、2)機(jī)械牽張可引起p120、occludin細(xì)胞連接蛋白降解，PP2預(yù)處理組，細(xì)胞連接蛋白降解減少，與牽張組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.機(jī)械牽張可誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞連接蛋白及骨架蛋白的降解:p120、E-cadherin、occludin、α-catenin。
　　2.機(jī)械牽張可引起肺上皮細(xì)胞E-cadherin胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)，使E-adherin胞內(nèi)吞增加。
　　3.機(jī)械牽張可促進(jìn)肺上皮細(xì)胞胞

8、漿骨架蛋白的解離，導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞連接縫隙增加。
　　4.機(jī)械牽張肺上皮細(xì)胞可激活c-Src激酶，是引起細(xì)胞連接蛋白降解、細(xì)胞間隙形成的主要原因。
　　5.c-Src抑制劑PP2抑制機(jī)械牽張引起的連接蛋白降解及細(xì)胞間隙的形成。以上結(jié)論表明，機(jī)械牽張可通過(guò)激活c-Src激酶，進(jìn)一步引起肺上皮細(xì)胞間連接蛋白的降解及解離，從而使細(xì)胞間隙增加，肺泡膜通透性增加，是誘導(dǎo)肺水腫發(fā)生的主要因素。而c-Src激酶抑制劑PP2可抑制機(jī)械牽張引起

9、的肺水腫，對(duì)機(jī)械牽張性肺損傷具有保護(hù)性作用。
　　實(shí)驗(yàn)二：p120在機(jī)械通氣肺損傷中的作用機(jī)制
　　目的：
　　本課題通過(guò)離體肺上皮細(xì)胞周期性牽張和活體小鼠VILI模型，對(duì)以下問(wèn)題進(jìn)行研究:(1)明確p120對(duì)RhoA激酶活性的調(diào)節(jié)。(2)明確p120通過(guò)調(diào)節(jié)RhoA對(duì)細(xì)胞緊密連接的影響。(3)明確p120在機(jī)械通氣肺水腫、肺損傷中的作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1.本研究采用c-Src抑制劑PP2及Rho

10、A抑制劑Y27632預(yù)處理MLE-2，用FX-4000T Flexercell細(xì)胞牽張儀對(duì)轉(zhuǎn)染的MLE-12進(jìn)行牽張，20％周期牽張，0.5HZ，牽張2h。牽張刺激后檢測(cè)以下指標(biāo):westem blot、免疫熒光共聚焦檢測(cè)E-cadherin、occludin表達(dá)量及細(xì)胞間隙的形成情況。
　　2.采用p120 siRNA/p120 cDNA轉(zhuǎn)染MLE-12細(xì)胞，再用細(xì)胞牽張儀對(duì)轉(zhuǎn)染的MLE-12進(jìn)行牽張，20％周期牽張，0.5HZ

11、，牽張2h。
　　3.將預(yù)先配置好的p120 siRNA-liposome混合物注入C57BL/6小鼠眼底靜脈叢，敲除小鼠體內(nèi)大部分p120基因后進(jìn)行機(jī)械通氣，將小鼠分為正常對(duì)照組、高潮氣量機(jī)械通氣組、p120基因敲除組、p120基因敲除后高潮氣量機(jī)械通氣組（每一組n=5），或小鼠腹腔注射c-Src抑制劑PP2、 RhoA抑制劑Y27632后進(jìn)行高潮氣量通氣，檢測(cè)以下指標(biāo):(1) western blot檢測(cè)p120脂質(zhì)體敲除效率

12、。(2)GST pull down assay檢測(cè)RhoA活性變化。(3)western blot檢測(cè)肺組織E-cadherin、occludin的表達(dá)。(4)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)肺泡灌洗液IL-6，TNF-α的生成量。(5)取肺組織稱量濕/干比值（Wet/Dry，W/D）。
　　結(jié)果：
　　1.與機(jī)械牽張組比較，c-Src抑制劑PP2或Rh

13、oA抑制劑Y27632預(yù)處理組可以減少機(jī)械牽張引起的E-cadherin及occludin降解。
　　2.(1)機(jī)械牽張可以激活RhoA，p120 siRNA處理組RhoA活性增加，機(jī)械牽張后，活性明顯增加。
　　(2)采用p120 siRNA轉(zhuǎn)染MLE-12后進(jìn)行牽張，p120 siRNA組E-cadherin降解，胞內(nèi)吞增加，經(jīng)牽張后胞內(nèi)吞增加明顯。與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);而p120cDNA轉(zhuǎn)染組

14、及轉(zhuǎn)染后機(jī)械牽張組E-cadherin降解或胞內(nèi)吞減少。
　　3.(1)經(jīng)眼底靜脈叢注射p120 siRNA的小鼠肺組織p120基因敲除70％。
　　(2)經(jīng)眼底靜脈叢注射p120 siRNA的小鼠肺組織RhoA活性與對(duì)照組比較增加。
　　結(jié)論：
　　1.c-Src抑制劑PP2或RhoA抑制劑Y27632可以逆轉(zhuǎn)機(jī)械牽張引起的細(xì)胞連接蛋白降解、細(xì)胞間隙增加。
　　2.p120降解可以激活RhoA激酶活性。<

15、br>　　3.p120 siRNA轉(zhuǎn)染后可加重E-cadherin內(nèi)吞，occludin降解，促使occludin與ZO-1解離，細(xì)胞間隙增加。但p120過(guò)表達(dá)組E-cadherin內(nèi)吞減少，occludin降解減少，occludin與ZO-1、p120與E-cadherin結(jié)合增加，細(xì)胞間隙修復(fù)。
　　第二部分 p120在感染性休克心肌損傷中的作用及機(jī)制
　　目的：
　　本課題通過(guò)LPS處理離體心肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞株H

16、9c2明確p120在感染性休克過(guò)程中對(duì)心臟收縮功能的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。
　　方法：
　　1.本研究采用LPS(1μg/ml)刺激小鼠心肌細(xì)胞0、2、4、6h，處理后檢測(cè)以下指標(biāo):(1)western blot檢測(cè)p120表達(dá)、PKCα活性;(2) CO-IP檢測(cè)p120去磷酸化水平及與N-cadherin之間的關(guān)系。
　　2.采用PKCα抑制劑G(o)6976或PKCαsiRNA轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞或心肌細(xì)胞，再用LPS(1

17、μg/ml)處理細(xì)胞0、2、4h。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組比較，LPS處理后心肌細(xì)胞p120表達(dá)降低，p120去磷酸化增加，PKCα被激活，p120與N-cadherin結(jié)合減少，且具有LPS處理的時(shí)間依賴性。
　　2.H9c2細(xì)胞經(jīng)PKCα抑制劑及PKCαsiRNA處理后，LPS組較對(duì)照組比較p120去磷酸化增加，PKCα被激活，p120與N-cadherin結(jié)合減少，心肌細(xì)胞間隙增加。而PKCα抑制劑G(o)