弱毒突變體對煙草脈帶花葉病毒的交叉保護作用.pdf

1、交叉保護是指一種病毒侵染植株后可阻止相同病毒的不同株系或親緣關(guān)系較近的另一種病毒侵染該植株的現(xiàn)象。交叉保護對病毒病的防治效果非常明顯，已成功地用來防治番茄花葉病、柑橘衰退病、番木瓜環(huán)斑病、黃瓜花葉病和西葫蘆黃色花葉病等多種病毒病。但交叉保護作為一種常規(guī)防治方法仍存在一定缺陷:弱毒株系有突變?yōu)閺姸局晗档娘L(fēng)險，弱毒株系可能與其它病毒有協(xié)生作用從而造成嚴重的損失，弱毒株系有可能傳播到非靶標寄主上造成危害。針對以上問題，本實驗對煙草脈帶花葉病毒

2、（Tobaccovein banding mosaic virus，TVBMV）輔助成分-蛋白酶(Helper component-proteinase，HC-Pro)中調(diào)控致病力、協(xié)生和蚜蟲傳毒的氨基酸進行突變，獲得多位點突變、與PVX無協(xié)生作用、不能蚜傳的弱毒突變體。本文主要結(jié)果如下:
　　 1.構(gòu)建了分別含有兩個、三個或四個氨基酸突變的弱毒突變體共10個，病毒致病力進一步下降，濃度降低。TVBMV HC-Pro中的NRT突

3、變?yōu)锳RT(B)、FRNK突變?yōu)镕INK(C)、CDN突變?yōu)镃KN(D)、IQN突變?yōu)镈EN(E)，可顯著降低TVBMV的致病力和植株體內(nèi)的濃度，同時使其喪失與PVX的協(xié)生能力。而HC-Pro中RITC突變?yōu)镋ITC(A)，TVBMV不能經(jīng)由蚜蟲傳播。本論文利用定點突變技術(shù)，將上述突變引入攜帶gfp的TVBMV侵染性克隆pCamTVBMV，獲得四個雙位點突變體BC、BD、CE、DE，四個三位點突變體ACE、ADE、BCE、BDE，兩個四

4、位點突變體ABCE、ABDE。
　　 利用農(nóng)桿菌浸潤法接種本氏煙（Nicotiana benthamiana），5-7天后野生型TVBMV產(chǎn)生脈明癥狀，新生葉片畸形，紫外燈下可見強烈的綠色熒光，后期頂部葉片嚴重畸形，植株不再生長。而多位點突變體接種的本氏煙上未出現(xiàn)明顯癥狀，熒光強度明顯降低或觀察不到。ELISA檢測結(jié)果顯示，突變體在植株中積累量很低，遠低于野生型。RT-PCR檢測證明在接種的本氏煙系統(tǒng)葉片中可以檢測到病毒RNA。

5、多位點突變體可系統(tǒng)侵染普通煙，但不產(chǎn)生明顯癥狀。
　　 2.弱毒突變體與PVX(Potato virus X, PVX)無協(xié)生作用。將攜帶TVBMV弱毒突變體與野生型PVX的農(nóng)桿菌GV3101培養(yǎng)液等體積混合后，共浸潤本氏煙和普通煙。野生型TVBMV和PVX復(fù)合侵染本氏煙，引起本氏煙的系統(tǒng)壞死，而TVBMV多位點突變體與PVX共浸潤本氏煙只是產(chǎn)生花葉癥狀，與單獨注射PVX的本氏煙癥狀相近。ELISA檢測進一步證實，多位點突變體與

6、PVX共浸潤本氏煙后，PVX CP積累量與單獨接種野生型PVX相近，顯著低于野生型TVBMV和PVX的植株中PVX的積累量。接種普通煙上的結(jié)果與本氏煙一致。這些結(jié)果表明，獲得的十個弱毒突變體喪失與PVX協(xié)生的能力。
　　 3.部分TVBMV弱毒突變體喪失蚜傳能力。將攜帶弱毒突變體ACE、ADE、ABCE和ABDE及野生型TVBMV的農(nóng)桿菌浸潤本氏煙，20天后，將無毒蚜蟲饑餓處理2h，飼毒5 min后轉(zhuǎn)移到將健康的本氏煙上，12h

7、后噴藥將蚜蟲殺死。蚜傳后6天，取食野生型TVBMV的蚜蟲接種的本氏煙無系統(tǒng)癥狀，但紫外光下可在頂部葉片局部觀察到綠色熒光;蚜傳后8天，取食野生型TVBMV的蚜蟲接種的本氏煙頂部葉片出現(xiàn)明脈現(xiàn)象，紫外燈下可見葉脈布滿綠色熒光。取食弱毒突變體ACE、ADE、ABCE和ABDE的蚜蟲接種的本氏煙8天后無任何癥狀，在紫外光下觀察不到綠色熒光，RT-PCR也檢測不到病毒。這表明弱毒突變體ACE、ADE、ABCE和ABDE喪失了蚜傳能力。
　

8、　 4.多位點突變體對野生型TVBMV有良好的保護效果。接種本氏煙后間隔11天、7天和3天接種強毒，攻毒后第5天、10天和15天，在自然光下觀察本氏煙上的癥狀，在紫外燈下觀察綠色熒光強度和面積，并進行ELISA檢測，結(jié)果表明，保護接種的本氏煙癥狀減輕，熒光強度減弱，病毒積累量降低，在保護期為7天時，突變體對TVBMV都有一定的保護效果，但保護期為11天時保護效果更好。在這些突變體中單位點突變體B、E和雙位點突變體BC交叉保護效果更好。