ω-芋螺毒素M ⅦA在畢赤酵母中的表達(dá)、純化與生物活性測(cè)定及其抗體的制備.pdf

1、本研究旨在構(gòu)建ω-CTXMⅦA基因真核表達(dá)質(zhì)粒，制備高純度的重組ω-CTXMⅦA蛋白，進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性；同時(shí)通過構(gòu)建ω-CTXMⅦA基因的原核表達(dá)載體，利用高純度的融合蛋白制備抗ω-CTXMⅦA的抗體，從而建立了一套簡(jiǎn)便、有效的檢測(cè)ω-CTXMⅦA的體系，為今后的產(chǎn)業(yè)化及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 1.ω-芋螺毒素MⅦA的免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用。 1.1重組pGEX-2T-CTX表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。 根據(jù)已知的

2、ω-CTXMⅦA氨基酸序列，按照大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計(jì)其DNA片段。對(duì)pGEX-2T質(zhì)粒進(jìn)行BamHI/EcoRI雙酶切，將退火后的ω-CTXMⅦA模板以T4DNA連接酶連接過夜，形成重組質(zhì)粒pGEX-2T-CTX(由本實(shí)驗(yàn)室陳永對(duì)構(gòu)建)。 1.2重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及目標(biāo)蛋白的純化。 挑取pGEX-2T-CTX轉(zhuǎn)化的BL21單菌落，于LB培養(yǎng)基中37℃振搖過夜，按1：50的比例稀釋于含氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)

3、中期，加入IPTG至終濃度為0.1mmol/L，37℃誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)。采用Glutathion-Sepharse4B親和層析法純化，純化后的融合蛋白經(jīng)12％SDS-PAGE鑒定和光密度掃描分析，其純度在91.6％，每升可收獲目的蛋白約15mg。 1.3多抗的制備。 用1.0mg的融合蛋白加完全弗氏佐劑，充分乳化后進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射，免疫后每?jī)芍芨骷訌?qiáng)免疫一次，共加強(qiáng)四次：抗原GST-CTX0.5mg加入0.5ml弗氏不完全

4、佐劑，多點(diǎn)皮下注射。 1.4多抗的純化。 利用50％～33％飽和度硫酸銨分級(jí)鹽析法對(duì)抗血清進(jìn)行初步純化，抗體粗品4℃透析過夜，采用弱陰離子交換柱層析，收集峰進(jìn)行電泳檢測(cè)。 1.5Westernblotting鑒定多抗的活性。 Westernblotting結(jié)果顯示純化的抗體分別能與融合蛋白GST-CTX、Trx-CTX發(fā)生特異性結(jié)合。這表明制備的抗體具有特異抗ω-CTXMⅦA的性質(zhì)。 1.6多抗效

5、價(jià)的測(cè)定。 分別以融合蛋白GST-CTX、Trx-CTX作為底物包被，通過ELISA的方法測(cè)定抗體的效價(jià)。結(jié)果表明純化后的抗體具有良好的特異抗ω-CTXMⅦA的能力，其效價(jià)約為1：8192。 1.7鑒定化學(xué)合成的ω-CTXMⅦA。 包被不同濃度的化學(xué)合成的ω-CTXMⅦA，通過間接ELISA的方法檢測(cè)底物。我們發(fā)現(xiàn)隨著包被濃度的上升其OD值也不斷增加，從而進(jìn)一步證明通過該方法檢測(cè)ω-CTXMⅦA的可行性。

6、 2.ω-芋螺毒素MⅦA在畢赤酵母中的表達(dá)、純化與生物活性測(cè)定。 2.1重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-CTX的構(gòu)建及鑒定。 根據(jù)已知的ω-CTXMⅦA氨基酸序列，按照畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)其DNA片段。對(duì)畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9進(jìn)行XhoI/EoRI雙酶切，將退火生成的ω-CTXMⅦA模板連接到pPIC9上，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-CTX。通過雙酶切、PCR及DNA測(cè)序，證明已構(gòu)建成功。 2.2畢赤酵母轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)

7、化子甲醇利用型的鑒定。 通過電穿孔的方法得到克隆先后涂于MM、MD平板篩選Mut+型，對(duì)在兩種平板上長(zhǎng)勢(shì)均較好的克隆，用來篩選高表達(dá)菌株。 2.3畢赤酵母轉(zhuǎn)化子PCR法鑒定。 以重組酵母的基因組為模板，用AOX1-up和AOX1-down為引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)，電泳在600bp左右處有一明顯條帶，結(jié)果顯示ω-CTXMⅦA已經(jīng)成功的整合至酵母基因組中。 2.4畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的表達(dá)。 隨機(jī)挑選的幾個(gè)M

8、ut+轉(zhuǎn)化子經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)96h后的上清經(jīng)18％SDS-PAGE檢測(cè)，電泳結(jié)果表明在4.1KDa處出現(xiàn)了目標(biāo)條帶。 2.5高表達(dá)菌株的篩選。 所有Mut+轉(zhuǎn)化子經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)96h后的上清經(jīng)18％SDS-PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)第6號(hào)克隆表達(dá)產(chǎn)物條帶顏色相對(duì)較深，初步定為高表達(dá)菌株。 2.6間接ELISA法鑒定。 直接包被轉(zhuǎn)化子表達(dá)上清，同時(shí)以空白菌株表達(dá)上清做陰性對(duì)照，用自制的抗ω-CTXMⅦA抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)檢

9、測(cè)孔OD值要明顯高于陰性對(duì)照孔。 2.7表達(dá)條件的優(yōu)化。 采用不同濃度的甲醇對(duì)高表達(dá)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24小時(shí)取樣，電泳鑒定發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中的分泌蛋白含量增多，且甲醇的濃度對(duì)目的蛋白的表達(dá)也有很大影響，綜合考慮最終確定最佳表達(dá)條件為：28℃、2.0％甲醇、96h。 2.8目的蛋白的純化。 電泳圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)灰度掃描，ω-CTXMⅦA表達(dá)量約占畢赤酵母分泌總蛋白量的60％左右。表達(dá)上清經(jīng)透

10、析除鹽后過弱陽離子交換柱，收集洗脫峰。經(jīng)SDS-PAGE鑒定和光密度掃描分析，其純度在90％左右。 2.9間接ELISA法鑒定純化蛋白。 包被不同濃度的純化蛋白，通過自制的抗ω-CTXMⅦA抗體檢測(cè)，從結(jié)果可以初步判斷該純化的蛋白就是重組ω-CTXMⅦA。 2.10重組ω-CTXMⅦA的MALDI-TOF-MS鑒定。 用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀對(duì)純化的重組ω-CTXMⅦA分析。結(jié)果顯示，其分子量為2

11、.63889kDa，而天然ω-CTXMⅦA的理論分子量為2.63922kDa，提示ω-CTXMⅦA的6個(gè)巰基均被氧化，且沒有被糖基化修飾。 2.11重組ω-CTXMⅦA的生物活性測(cè)定。 采用經(jīng)典的小鼠熱板法和大鼠熱尾法確定重組ω-CTXMⅦA的生物學(xué)活性。測(cè)活結(jié)果表明本研究表達(dá)的重組ω-CTXMⅦA具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛活性，其鎮(zhèn)痛效應(yīng)大約是嗎啡的800倍。 綜上所述： 1.由于目前國(guó)內(nèi)外還沒有一種有效的免疫方法

12、用來檢測(cè)ω-CTXMⅦA，本實(shí)驗(yàn)采用基因工程的方法，在大腸桿菌中將ω-CTXMⅦA與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)融合表達(dá)，并以純化的GST-CTX作為抗原免疫兔子制備多抗。通過另一種融合蛋白Trx-CTX檢測(cè)其特異抗ω-CTXMⅦA的效價(jià)。成功的制備抗ω-CTXMⅦA的抗體為今后檢測(cè)ω-CTXMⅦA提供了一種簡(jiǎn)便、靈敏的方法。 2.經(jīng)過間接ELISA、熱板、熱尾等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在畢赤酵母中成功的表達(dá)出有生物活性的重組ω-CTXMⅦA