從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控探討NGF-TrkA保護大鼠心臟缺血-再灌注損傷的作用及機制.pdf

1、目的：以在體大鼠心臟局部缺血再灌注模型為研究對象，探討內(nèi)源性NGF在心肌缺血和再灌注早期表達的特點;以離體大鼠心臟全心停灌復(fù)灌模型為研究對象，觀測外源性NGF對IRI心臟功能恢復(fù)、心肌損傷程度、凋亡程度的影響，探討其量效關(guān)系;以H9C2心肌細胞缺氧復(fù)氧模型為研究對象，觀測培養(yǎng)液中加入外源性NGF對細胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路蛋白的表達、心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，闡明NGF-TrkA對心肌細胞缺氧后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細胞凋亡的影響，探討兩者的

2、相關(guān)性及調(diào)控機制。
　　方法：
　　第一部分：健康成年雄性SD大鼠24只，鼠齡8～10周，體重200～300g。將大鼠心臟隨機分至四組(n=6)。假手術(shù)組（S組）:大鼠開胸后于LAD下用細線穿過但不結(jié)扎，持續(xù)180 min;單純?nèi)毖M（I組）:開胸后結(jié)扎LAD30 min;缺血再灌注組（I/R組）:結(jié)扎LAD30 min后復(fù)灌120 min; K252a組:缺血前30 min皮下注射K252a50μg/kg，缺血和復(fù)灌過程同

3、I/R組。記錄缺血前、缺血30min時及再灌注120min各組大鼠心率(Heart rate，HR)，平均動脈壓（Mean arterial pressure，MAP)。各組實驗結(jié)束時頸總動脈取血，ELISA法測定血清LDH和CK-MB濃度。各組實驗結(jié)束后取心尖組織，RT-PCR測定NGFmRNA，Western-blot測定NGF表達的水平。I/R組再灌注末取左心室前壁心肌組織（缺血區(qū)，IS區(qū)）和右室壁心肌組織（非缺血區(qū)，NIS區(qū)），

4、免疫組化法測定NGF的表達。
　　第二部分：健康成年雄性SD大鼠48只，鼠齡8～10周，體重200～300 g。將大鼠離體心臟隨機分至6組(n=8):假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I/R組）、NGFⅠ/Ⅱ/Ⅲ組、NGF+K252a組。Sham組K-H液持續(xù)灌注225min; I/R組K-H液平衡灌注75min，然后停灌30 min，復(fù)灌120min; NGFⅠ/Ⅱ/Ⅲ組平衡灌注45min后，分別采用含NGF10、100、1

5、000 ng/ml的K-H液繼續(xù)灌注30min，停灌30 min，復(fù)灌120 min;NGF+K252a組平衡灌注15min后，用含K252a100nM的K-H液灌注30min，再用含NGF100 ng/ml的K-H液繼續(xù)灌注30min，停灌30 min，復(fù)灌120m in。測定平衡灌注末期(BL)及再灌后5 min、30min、60 min、120 min時各組心功能指標(biāo):心率(HR)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室發(fā)展壓(LVDP

6、)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)。停灌前即刻和再灌注后5min收集冠脈流出液2ml，測定流出液中乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK-MB)的濃度。各組實驗結(jié)束取左心室前壁心肌組織石蠟切片，TUNEL染色后檢測心肌凋亡。
　　第三部分：培養(yǎng)的H9C2心肌細胞，按照不同處理方式分組?？瞻讓φ战M（C組）:用正常培養(yǎng)液在通有95％空氣+5％CO2的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8h;缺氧復(fù)氧組（H/R組）:用預(yù)先經(jīng)95％N2+5％C

7、O2混合氣飽和的無氧培養(yǎng)液在37℃無氧培養(yǎng)箱(95％N2+5％CO2)培養(yǎng)4h，再用含氧培養(yǎng)液在37℃正常培養(yǎng)箱（95％空氣+5％CO2）復(fù)氧培養(yǎng)4h; NGFⅠ～Ⅲ組:分別在缺氧前4h，缺氧前即刻和復(fù)氧前即刻在相應(yīng)的培養(yǎng)液中加入NGF，使NGF在培養(yǎng)液中的濃度達到100ng/ml; NGF1～4組:復(fù)氧培養(yǎng)液中加入NGF復(fù)氧4h，使NGF在培養(yǎng)液中的濃度分別達到1 ng/ml、10 ng/ml、100 ng/ml、1000 ng/ml

8、，其余處理同H/R組;NGF+K252a組，復(fù)氧培養(yǎng)液中加入NGF和K252a復(fù)氧4h，NGF和K252a在培養(yǎng)液中的濃度分別為100 ng/ml和100 nM，其余處理同H/R組;NGF+LY294002組，復(fù)氧培養(yǎng)液中加入NGF+LY294002復(fù)氧4h，NGF和LY294002在培養(yǎng)液中的濃度分別為100 ng/ml和50μM，其余處理同H/R組;各組處理結(jié)束后CKK法測定細胞存活率，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Western-bl

9、ot測定GRP78，CHOP, caspase-12，p-Akt/Akt等蛋白表達水平，熒光染色后激光共聚焦顯微鏡測定細胞內(nèi)游離鈣離子熒光強度。
　　結(jié)果：
　　第一部分：(1)缺血30min后和再灌注120min后，I組、I/R組和K252a組HR與S組相比均明顯增加(P＜0.0001);缺血30min時，I組、I/R組和K252a組MAP均低于S組（P＜0.05），K252a組低于I組和I/R組(P＜0.05)。再灌注1

10、20min時，K252a組MAP仍然低于I/R組和S組(P＜0.05)。(2)與S組相比，I組、I/R組和K252a組處理結(jié)束時血清CK-MB和LDH濃度均明顯升高(P＜0.01)，其中K252a組的心肌酶濃度明顯高于其他兩組（P＜0.01），I/R組高于I組（P＜0.01）。(3)在經(jīng)過I/R處理的大鼠心臟上，IS區(qū)NGF的陽性表達率37％±4％，NIS區(qū)NGF表達率12％±3％，IS區(qū)明顯高于NIS區(qū)(P＜0.01)。(4)與S組相

11、比，I組、I/R組、K252a組NGFmRNA和NGF蛋白的表達均明顯增加(P＜0.0001)，其中I/R組和K252a組NGFmRNA的表達高于I組(P＜0.0001)，I/R組和K252a組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　第二部分：(1)再灌注120min時，I/R組、NGFⅠ/Ⅱ/Ⅲ組、NGF+K252a組HR，LVDP，±dp/dtmax均明顯降低，NGFⅠ/Ⅱ組LVDP高于NGFⅢ組(P＜0.01)，NGFⅡ

12、組±dp/dtmax明顯高于NGFⅢ組(P＜0.01)，NGF+K252a組和I/R組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。再灌注120min時上述各組LVEDP均高于Sham組，NGFⅡ組LVEDP明顯低于除Sham組外的其余各組(P＜0.01)。(2)再灌注后，I/R組、NGFⅠ/Ⅱ/Ⅲ組、NGF+K252a組兩種LDH、CK-MB濃度和凋亡率均不同程度增加，高于Sham組(P＜0.001)。在給予NGF的三組中，NGFⅡ組心肌酶濃

13、度和凋亡率最低(P＜0.01)，NGFⅢ組細胞凋亡率最高（P＜0.01）。
　　第三部分：(1)與胍組比較，缺氧前4h(NGFⅠ組)、缺氧前即刻(NGFⅡ組)和復(fù)氧前即刻(NGFⅢ組)給予NGF均能提高H9C2心肌細胞缺氧復(fù)氧后的存活率(P＜0.05)，NGFⅢ組細胞存活率高于NGFⅠ組和Ⅱ組(P＜0.05);與H/R組比較，復(fù)氧液中10 ng/ml和100ng/ml的NGF均可提高H9C2心肌細胞缺氧復(fù)氧后的存活率(P＜0.05

14、)，其中100 ng/ml的NGF心肌保護效果較明顯(P＜0.01)。(2)與對照組相比，經(jīng)過缺氧4h、復(fù)氧4h處理的H9C2心肌細胞（H/R組）凋亡率明顯升高(P＜0.0001)，NGF可明顯減少細胞凋亡（vs H/R組，P＜0.0001）。TrkA受體阻斷劑K252a和PI3K抑制劑LY294002可完全阻斷NGF抗心肌細胞凋亡的作用，細胞凋亡率與單純?nèi)毖鯊?fù)氧組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。(3) NGF可促進缺氧復(fù)氧后心肌細胞

15、P-Akt的表達，NGF組p-Akt的表達水平明顯高于其他組（P＜0.0001）。同時使用TrkA受體阻斷劑K252a或PI3K抑制劑LY294002時，p-Akt的表達水平明顯下降，其中NGF+LY294002組表達水平最低(P＜0.0001)。與Sham組比較，H/R組心肌細胞GRP78、CHOP、Caspase12的表達水平均明顯升高(P＜0.01)。給予NGF可減少上述蛋白的表達，同時給予K252a或LY294002時，上述蛋白

16、的表達均再次增加，NGF+LY294002組GRP78，CHOP的表達高于H/R組(P＜0.01)。(4)幾種蛋白中，GRP78，CHOP，Caspase-12的蛋白表達與心肌細胞凋亡率呈正相關(guān)，r值分別為0.19，0.63，0.67，P＜0.01或0.05; P-Akt表達與心肌細胞凋亡率呈負相關(guān)，r值為-0.45，P＜0.05;(5)各組心肌細胞H/R后胞內(nèi)鈣離子熒光強度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)
　　結(jié)論：
　　

17、(1)心肌缺血后早期即可誘發(fā)NGF的高表達，并將這種高表達延續(xù)至再灌注過程。再灌注早期，NGF的表達在缺血區(qū)心肌細胞尤為明顯，該現(xiàn)象可能是缺血心肌的一種內(nèi)源性保護性反應(yīng)
　　(2)外源性NGF對缺血心臟具有非神經(jīng)源性的抗細胞凋亡作用，且該作用存在劑量依賴性。適當(dāng)劑量的外源性NGF預(yù)處理可減輕離體心臟缺血再灌注損傷，減少心肌細胞凋亡;當(dāng)NGF劑量過高時心肌保護效應(yīng)消失，甚至加重心肌損傷。
　　(3)NGF可通過PI3K-Akt