Erbb4調(diào)控心臟再生的分子學(xué)特征.pdf

1、一、背景與目的:
　　斑馬魚(yú)及新生乳鼠心臟再生能力的發(fā)現(xiàn)給再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了重要的研究模型及方法。譜系追蹤技術(shù)于再生領(lǐng)域的應(yīng)用證實(shí)，斑馬魚(yú)及新生乳鼠心臟損傷后再生的心肌細(xì)胞均主要來(lái)源于損傷區(qū)尚存心肌細(xì)胞的去分化及增殖。成人等成年哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞多已退出細(xì)胞周期，自然狀態(tài)下無(wú)法發(fā)生去分化及增殖，這可能就是其心臟再生能力十分有限的原因。因此明確心肌細(xì)胞去分化及增殖的病理生理機(jī)制成為自然心臟再生研究的關(guān)鍵所在。
　　Gemberl

2、ing等人研究表明神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(Neuregulin1，Nrg1)是種強(qiáng)力的促心肌細(xì)胞分裂因子，即使沒(méi)有心臟損傷也可以激活斑馬魚(yú)心臟再生進(jìn)程。并且在未受損傷心室中他們也檢測(cè)到erbb2(erb-b2 receptor tyrosine kinase2)及erbb4b(erb-b2 receptortyrosine kinase4)在mRNA水平的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)通過(guò)化學(xué)抑制劑阻斷Erbb2受體可以抑制斑馬魚(yú)心臟再生時(shí)的心肌細(xì)胞增殖。Be

3、rsell等人對(duì)小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Nrg1可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期重啟而促進(jìn)成鼠心臟再生及心梗后心功能恢復(fù)，而ErbB4是Nrg1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞周期重啟必不可少的受體。該研究還發(fā)現(xiàn)Nrg1可以刺激單核心肌細(xì)胞增殖，但對(duì)多核細(xì)胞作用明顯減弱。而單核心肌細(xì)胞正是斑馬魚(yú)及新生7日(7days postnatal，P7)內(nèi)小鼠的主要心肌細(xì)胞類型。新生小鼠在P7后失去心臟再生能力，這與心肌細(xì)胞退出細(xì)胞周期的時(shí)間窗吻合。有趣的是，近期也有研究表明乳鼠出生后

4、ErbB2受體表達(dá)顯著降低，而此時(shí)Nrg1誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖作用也明顯下降，提示ErbB2受體的減少可能是成年哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞對(duì)Nrg1反應(yīng)性下降的一個(gè)原因。
　　Nrg1是一種細(xì)胞外生長(zhǎng)因子，其受體為具有跨膜結(jié)構(gòu)的酪氨酸激酶家族，包括ErbB1，2，3，4。ErbB受體在Nrg1的誘導(dǎo)下可以形成二聚體，激活胞內(nèi)區(qū)域磷酸化而發(fā)揮活性作用。ErbB4是該家族受體中唯一既能與Nrg1直接結(jié)合又可發(fā)揮其酪氨酸激酶活性的受體，而ErbB2

5、是一種共受體，并不能直接與Nrg1結(jié)合。另外，由于ErbB4在緊挨跨膜片段的膜外部分存在相對(duì)較長(zhǎng)的“莖稈樣”(stalk)結(jié)構(gòu)，在與Nrg1結(jié)合后，ErbB4可從該處發(fā)生蛋白水解斷裂，形成釋放入細(xì)胞外的120KDa的胞外部分以及80KDa的胞內(nèi)部分，該水解過(guò)程需要腫瘤壞死因子α轉(zhuǎn)化酶(Tumor Necrosisfactor-α-converting enzyme，TACE)的參與。80KDa的胞內(nèi)部分在另一種膜蛋白γ分泌酶的作用下進(jìn)一

6、步水解斷裂而從細(xì)胞膜釋放入胞內(nèi)成為ErbB4-ICD(intracellulardomain)，進(jìn)而可轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)作為一種轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞周期的調(diào)控。
　　雖然目前Nrg1/ErbB信號(hào)通路對(duì)心臟再生的作用已經(jīng)得以明確，但對(duì)Nrg1重啟細(xì)胞周期的作用機(jī)制尚不清楚，其關(guān)鍵的直接受體Erbb4參與細(xì)胞周期重啟并調(diào)控心臟再生的具體作用機(jī)制尚不明確。因此，研究Erbb4受體在心臟中的表達(dá)模式對(duì)于其機(jī)制探索十分重要。本研究將通過(guò)對(duì)比可自然再

7、生的模式生物與不可再生的成年哺乳動(dòng)物心室中Erbb4的表達(dá)差異，結(jié)合Nrg1刺激作用下Erbb4受體的表達(dá)變化，為探索Erbb4重啟細(xì)胞周期的作用機(jī)制提供重要的數(shù)據(jù)資料。
　　二、研究方法:
　?。ㄒ唬┌唏R魚(yú)及小鼠實(shí)驗(yàn)操作
　　選用6-8個(gè)月齡的AB野生型斑馬魚(yú)用于成年斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)。本研究使用的已發(fā)表的轉(zhuǎn)基因魚(yú)系有fli1α1∶EGFP，wt1∶EGFP，gata4∶EGFP，cmlc2∶ CreER，β-act∶ lo

8、xP-mTag-BFP-STOP-loxP-Nrg1(β-act2∶BSNrg1)。斑馬魚(yú)心尖切除術(shù)依據(jù)Poss發(fā)表的方法進(jìn)行，分別于3dpa、7dpa及14dpa收集RNA、蛋白及組織學(xué)標(biāo)本，并以未損傷心臟作為對(duì)照。
　　小鼠實(shí)驗(yàn)選取ICR/CD-1型孕鼠及2月齡成鼠。將孕期15日的孕鼠飼養(yǎng)至分娩，分別收集P1、P4、P8及2月齡成鼠心臟組織蛋白。
　　為誘導(dǎo)斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞表達(dá)Nrg1，將cmlc2∶CreER與β-act

9、2∶BSNrg1魚(yú)系進(jìn)行雜交，篩選出雙重轉(zhuǎn)基因魚(yú)系。將4-OH-Tamoxifen(4-HT)稀釋于丙二醇中，配制成濃度為10μmol的魚(yú)水并同時(shí)處理40dpf的Tg（cmlc2∶CreER;β-act2∶BSNrg1及β-act2∶ BSNrg1）斑馬魚(yú)，間隔4-5日重復(fù)1次，再過(guò)4-5日后收集心臟。
　　為實(shí)現(xiàn)化學(xué)方法抑制TACE活性，對(duì)成年野生型斑馬魚(yú)行心尖切除術(shù)，于2-3dpa使用金屬蛋白酶抑制劑GM6001（濃度為10μ

10、M）的魚(yú)水處理，并收集心臟組織蛋白進(jìn)行檢測(cè)。
　?。ǘ?shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)
　　用TRIzol(R)以常規(guī)方法抽提uncut、3dpa及7dpa斑馬魚(yú)全心室RNA，用SuperScript(R)Ⅲ First-Strand synthesis試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用Roche LightCycler(R)480Real-Time PCR系統(tǒng)對(duì)erbb4進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，采集循環(huán)值，單個(gè)時(shí)間點(diǎn)

11、至少重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)并以斑馬魚(yú)ef1α作為內(nèi)參。使用的引物序列為ef1α∶F-AGCTCGTTGGAGTCAAC，R-TGCGCTGACTTCCTTGGTG;erbb4a∶F-GTTGTGCCGTCGAACAATAG，R-CTGGCACTGATCCTCCTGA;erbb4b∶ F-ACTCAACGTGTTTCGCACTG，R-GCTCTGCCTCCAATAGTTGC。
　　（三）心室組織細(xì)胞核、細(xì)胞漿蛋白分離
　　收集斑馬魚(yú)及小

12、鼠心臟，去除心室外多余組織，根據(jù)組織體積加入相應(yīng)量的細(xì)胞膜裂解液Buffer A(10 mM HEPES，PH=7.5;10 mM KCl;1 mM EDTA;2 mM MgC12，1％NP40)，勻漿并于5009×5min離心，吸取上清即為細(xì)胞漿蛋白。復(fù)洗后剩余部分加入50μl細(xì)胞核裂解劑Buffer B（Buffer A基礎(chǔ)上加500mM NaC1及25％ Glycerol），靜置后120009高速離心，上清即為核蛋白。
　　

13、（四）蛋白免疫印跡檢測(cè)(Western Blot)
　　采用Western Blot分別檢測(cè)斑馬魚(yú)再生過(guò)程、新生乳鼠及成鼠的全蛋白、核漿分離蛋白中的ErbB4、Tropomyosin、GAPDH的表達(dá)。組織全蛋白標(biāo)本的提取采用RIPA裂解液。各蛋白樣品分別加入4×Sample Buffer及10×Reducing Buffer，配制成1×Sample Buffer。選用濃度為8％的預(yù)制凝膠，并使用iblot⑩轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)將蛋白轉(zhuǎn)移至硝

14、化纖維素膜，修剪后用Odyssey Blocking Buffer于室溫下封閉1小時(shí)，4℃孵育一抗16小時(shí)。PBST洗滌3次，室溫避光孵育熒光二抗1小時(shí)。PBST洗滌3次后使用Odyssey紅外激光掃描成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶信號(hào)。一抗?jié)舛葹?anti-ErbB4(1∶1000)，anti-Tropomyosin(1∶1000)，anti-GAPDH(1∶1000)。二抗?jié)舛葹?anti-mouse(1∶10000)，anti-rabbit(1

15、∶10000)。
　　（五）組織免疫熒光檢測(cè)
　　1.組織切片免疫熒光染色
　　將斑馬魚(yú)心臟組織制作成石蠟切片，脫蠟后加熱引導(dǎo)下于VECTOR抗原修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù)，隨后使用組織切片封閉液（5％山羊血清，2.5％的馬血清及0.3％Triton X-100，稀釋于TBST）室溫下封閉45min。4℃下孵育一抗16小時(shí)，TBST洗滌3次，室溫下孵育二抗1小時(shí)，DAPI復(fù)染后封片。使用Zeiss LSM710共聚焦顯微鏡對(duì)

16、切片進(jìn)行檢測(cè)并攝圖。一抗及濃度:anti-ErbB4(1∶200)，anti-EGFP(1∶500)，anti-Tropomyosin(1∶200)。二抗及濃度:anti-rabbit(1∶200)，anti-mouse(1∶200)，anti-Chicken(1∶500)，所有的組織切片檢測(cè)均依據(jù)研究員單盲實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。
　　2.全心組織熒光染色
　　收集麻醉處死的fli1α∶EGFP斑馬魚(yú)心臟，清洗后4℃下于4％的PFA

17、固定24h，并于Dent's液(25mlH202，10mlDMSO，40mlMeOH)漂白24小時(shí)，隨后Dent's固定液(50mlDMSO，200mlMeOH)再次固定24小時(shí)。清洗后孵育一抗5天，洗去一抗并避光條件孵育二抗5天，洗去二抗并于BABB液(50ml benzyl alcohol，100ml benzylbenzoate)進(jìn)行透明化處理后固定于1％瓊脂糖凝膠于共聚焦顯微鏡下攝片。
　　3.心肌細(xì)胞爬片熒光染色

18、　　將24孔板中的心肌細(xì)胞爬片于4％ PFA/PBS中固定10分鐘，打孔10分鐘后以封閉液封閉30分鐘，隨后一抗4℃下孵育16小時(shí)。PBS洗凈后室溫下避光孵育二抗30分鐘。DAPI復(fù)染后封片，以熒光顯微鏡攝片。一抗及濃度:anti-ErbB4(1∶200)或anti-a-actinin(1∶300)。二抗及濃度:488 anti-mouse(1∶200)。
　?。┙y(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　Western Blot結(jié)果通過(guò)灰度測(cè)量軟

19、件得到計(jì)量資料，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次及以上。兩組獨(dú)立樣本進(jìn)行t檢驗(yàn)，多因素樣本采用方差分析，以P＜0.05作為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。
　　三、研究結(jié)果:
　?。ㄒ唬〆rbb4在斑馬魚(yú)心臟再生過(guò)程中的表達(dá)
　　erbb4的mRNA檢測(cè)結(jié)果以ef1a作為內(nèi)參進(jìn)行校正，結(jié)果顯示，在未損傷的斑馬魚(yú)心臟中均有erbb4a及erbb4b的表達(dá)。以未損傷斑馬魚(yú)心臟為對(duì)照，erbb4a及erbb4b的表達(dá)在7dpa時(shí)均

20、顯著下調(diào)。
　?。ǘ〦rbb4在斑馬魚(yú)心臟再生過(guò)程中的表達(dá)
　　Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明Erbb4在斑馬魚(yú)心臟中主要以約60KDa的截短蛋白(Erbb4-ICD)形式存在，180KDa的全長(zhǎng)蛋白含量相對(duì)較低。為了檢測(cè)Erbb4在空間分布，我們進(jìn)行了免疫熒光染色，并進(jìn)一步分離了核漿蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。熒光檢測(cè)結(jié)果顯示Erbb4表達(dá)于全心范圍而心肌細(xì)胞核區(qū)的表達(dá)豐度較高，并且在未損傷心臟及損傷心臟

21、中均有表達(dá)。Western結(jié)果也顯示，在斑馬魚(yú)未損傷的心臟或者再生的心臟中，截短的Erbb4蛋白都主要表達(dá)于細(xì)胞核中，細(xì)胞漿中可檢測(cè)到全長(zhǎng)蛋白及剩余的截短蛋白表達(dá)。
　　斑馬魚(yú)未損傷心臟組織切片及全心掃描結(jié)果的免疫熒光共染色結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞、心臟血管內(nèi)皮細(xì)胞及心外膜細(xì)胞均可檢測(cè)到Erbb4受體的表達(dá)，并且在心肌細(xì)胞內(nèi)的分布主要位于細(xì)胞核區(qū)。
　?。ㄈ〦rbB4在新生乳鼠及成鼠心臟中的表達(dá)
　　Western Blo

22、t檢測(cè)結(jié)果表明，在小鼠心臟中，ErbB4同樣主要以約60KDa的ICD與180KDa的全長(zhǎng)蛋白兩種形式存在，ErbB4-ICD的表達(dá)量顯著高于全長(zhǎng)蛋白。其中ICD主要分布在細(xì)胞核中，全長(zhǎng)蛋白僅分布于細(xì)胞漿中。從P1到P8，這兩種形式的蛋白表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。與新生乳鼠相比，已退出細(xì)胞周期的成鼠心臟中ErbB4-ICD及全長(zhǎng)蛋白均顯著減少。
　?。ㄋ模㎞rg1誘導(dǎo)未成年斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞核中Erbb4的表達(dá)
　　乳鼠及成鼠的對(duì)比研

23、究表明心臟中的ErbB4-ICD及全長(zhǎng)蛋白在小鼠心臟晚期發(fā)育階段逐漸減少。為探索斑馬魚(yú)心臟發(fā)育至成熟過(guò)程Erbb4的變化，我們對(duì)比了未成年斑馬魚(yú)與成年斑馬魚(yú)心臟中Erbb4的表達(dá)。組織石蠟切片熒光染色結(jié)果表明，未成年斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞核中Erbb4的表達(dá)水平明顯低于成年斑馬魚(yú)。
　　為探索Nrg1對(duì)Erbb4受體表達(dá)的影響，我們通過(guò)4-HT處理Tg（cmlc2∶CreER;β-act2∶ BSNrg1）而誘導(dǎo)40dpf的斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞

24、特異性表達(dá)Nrg1，并以Tg（β-act∶BSNrg1）作為對(duì)照組，對(duì)55dpf的心臟石蠟切片行Erbb4及Tropomyosin的免疫熒光染色。結(jié)果顯示，Erbb4的心肌細(xì)胞核區(qū)染色明顯強(qiáng)于對(duì)照組，這表明心肌細(xì)胞過(guò)表達(dá)Nrg1可以誘導(dǎo)斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞核中Erbb4的表達(dá)。
　　（五）斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞核內(nèi)ICD可能直接由erbb4翻譯而來(lái)
　　TACE是ErbB4蛋白水解所必要的一種金屬蛋白酶，GM6001為基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑

25、，可抑制TACE活性。對(duì)斑馬魚(yú)行心尖切除術(shù)后于2-3dpa予以10μM化學(xué)抑制劑GM6001處理，并提取心臟組織蛋白行的Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，60KDa左右的Erbb4-ICD表達(dá)量未見(jiàn)顯著改變。這提示細(xì)胞核中的Erbb4-ICD可能并非來(lái)自全長(zhǎng)蛋白的水解。
　　對(duì)斑馬魚(yú)erbb4開(kāi)放閱讀框的分析表明，erbb4除了可以翻譯成180KDa的全長(zhǎng)蛋白外，也可以直接翻譯為大小約63KDa的碳-端蛋白，這與我們發(fā)現(xiàn)的60

26、KDa左右的ICD分子量大小基本一致，說(shuō)明核內(nèi)的Erbb4-ICD可能由erbb4以替代起始位點(diǎn)直接翻譯而成。
　　四、結(jié)論:
　?。ㄒ唬〦rbB4在可自然再生的斑馬魚(yú)及新生乳鼠體內(nèi)主要有Erbb4-ICD及全長(zhǎng)蛋白兩種形式，并分別存在于細(xì)胞核及細(xì)胞漿中。
　?。ǘ┰诓痪邆湓偕芰Φ某墒笮呐K中，ErbB4-ICD及全長(zhǎng)蛋白在對(duì)應(yīng)區(qū)域的表達(dá)顯著降低。
　　（三）未成年斑馬魚(yú)心肌細(xì)胞核內(nèi)Erbb4的表達(dá)明顯低于成年

27、斑馬魚(yú)，心肌細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)Nrg1可誘導(dǎo)細(xì)胞核區(qū)的Erbb4表達(dá)顯著增強(qiáng)。由于Erbb4全長(zhǎng)蛋白并不分布于細(xì)胞核中，這表明Erbb4受Nrg1刺激后可能通過(guò)形式或位置的改變來(lái)參與細(xì)胞周期的調(diào)控。
　?。ㄋ模┮种瓢唏R魚(yú)TACE活性，心室中ErbB4-ICD表達(dá)水平未見(jiàn)明顯變化，說(shuō)明細(xì)胞核中60KDa的ICD可能并非主要由全長(zhǎng)蛋白水解而來(lái)。對(duì)斑馬魚(yú)erbb4開(kāi)放閱框的分析對(duì)比表明，細(xì)胞核中的Erbb4-ICD可能由由erbb4以替代