正肝方對大鼠肝癌前病變及人肝癌細胞分化和端粒酶的影響.pdf

1、目的：本研究采用組織化學、免疫組化、RT-PCR、PCR-ELISA等方法觀察了正肝方對黃曲霉毒素B1(AFB1)誘發(fā)的大鼠肝癌前病交的影響，以及正肝方藥物血清對人肝癌細胞分化和端粒酶的影響，以明確正肝方對肝癌的預防作用及其主要作用機制。本研究為將正肝方開發(fā)為肝癌預防新藥，在臨床上推廣應用，提供一定的理論依據(jù)。 材料與方法： 1.動物體內實驗：Wister雄性大鼠100只，隨機分為4組：模型對照組(A組)30只、正肝方小

2、劑量預防組(B組)30只、正肝方大劑量預防組(C組)30只、正常大鼠對照組(D組)10只。除正常大鼠對照組外，先后用AFB1和2-乙酰氨基芴(2-AAF)處理各組大鼠造模。正肝方大、小劑量預防組在造模期間，將正肝方水劑(單味免煎中藥粉劑按比例稱取，用無菌蒸餾水溶解，配成0.3g/ml和0.6g/ml的水劑)按10ml/kg分別灌喂大鼠；模型對照組(A組)用無菌蒸餾水按10ml/kg灌喂大鼠．8周后處死大鼠，采血，取肝組織標本．將肝組織標

3、本分別HE染色和鈾鉛染色，光鏡、電鏡病理觀察；采用組織化學法結合電腦圖象分析檢測肝組織γ-谷氨酰轉移酶(GGT)陽性灶、免疫組織化學法(IHC)檢測肝組織谷胱甘肽S-轉移酶-π(GST-P)陽性灶、增殖細胞核抗原(PCNA)、甲胎蛋白(AFP)、胰島素樣生長因子Ⅱ (IGF-Ⅱ)和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)蛋白表達，逆轉錄PCR (RT-PCR)法檢測肝臟組織IGF-Ⅱ、Cyclin D1

4、和CDK4基因表達；比色法檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、GGT，總膽紅素(TBIL)、白蛋白(ALB)生化指標。 2.體外血清藥理實驗：正肝方水煎劑(1.5g/ml)，灌喂正常大鼠，每甚2次，連續(xù)3d，于第4d，1次給予全日劑量后1h采血，制備藥物血清，藥物血清經(jīng)56℃滅活30min。以正常鼠血清為陰性對照，維甲酸為陽性對照，將藥物血清溫育Bel-7402人肝癌細胞。噻

5、唑藍(MTT)比色法測定細胞增殖，圖象分析系統(tǒng)測定細胞核質比，放射免疫法測定細胞分泌的AFP含量，動態(tài)比色法測定細胞內oGT和ALP活性，多聚酶鏈反應一酶聯(lián)免疫吸附法(PCR-ELISA法)檢測細胞端粒酶活性。 結果： 1.動物體內實驗： 1.1各組大鼠一般情況：動物實驗開始時，各組大鼠體重大小較一致，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。在整個實驗過程中，正常對照組的大鼠體重增長大于造模組(P＜0.01)；模型組(A組

6、)、正肝方小劑量組(B組)和大劑量組(c組)3組間大鼠生長情況相似，體重增長無差異顯著性(P＞0.05).表明正肝方無論是大劑量還是小裁量，對大鼠都是安全的，沒有明顯的毒副作用．實驗結束時，A組死亡12只，B組15只，C組13只，D組無死亡． 1.2各組大鼠肝組織形態(tài)及細胞超微結構交化：光鏡下：A、B、C組大鼠的肝組織切片(HE染色)可見到散在的，大小不等的增生肝細胞灶或結節(jié)；肝細胞增生灶多少不等，A組最多，C組最少；灶/結節(jié)內

7、以嗜堿性肝細胞為主，個別灶內肝細胞濁腫變形、點狀壞死；部分灶/結節(jié)內肝細胞異型，體積變大，見少量雙核、核深染、巨核細胞。電鏡下：增生灶內肝細胞可見細胞器排列集中，胞質內含大量線粒體，粗面內質網(wǎng)擴張。細胞核大，不規(guī)則，核仁突出，部分細胞雙核，可見兩個以上核仁，染色質疏松，邊集． 1.3各組大鼠肝組織GGT和GST-P陽性灶的比較：正肝方小劑量組的每個GGT灶面積(mm2/個)少于模型組(P<0.05)，但單位面積GGT灶個數(shù)(個/

8、cm2)、單位面積灶的總面積(mm2/cm2)無明顯減少(P>0.05)．正肝方大劑量組的單位面積GGT灶個數(shù)、單位面積灶的總面積和每個灶面積與模型組比均顯著減少(P<0.01)．與小劑量組比，正肝方大劑量組的GGT灶個數(shù)、灶的總面積和每個灶面積顯著減少(P<0.01)，提示正肝方減少AFB1誘發(fā)的大鼠肝組織GGT灶面積的作用有一定的量效關系． 與模型組比，正肝方小劑量組的每個GST-P灶面積(mm2/個)，單位面積GST-P灶

9、個數(shù)(個/cm2)、單位面積灶的總面積(mm2/cm2)無明顯減少(P>0.05)．正肝方大劑量組的單位面積GST-P灶個數(shù)、單位面積灶的總面積和每個灶面積與模型組比均顯著減少(P<0.05或P<0.01)，提示大劑量正肝方具有抑制癌前病變肝組織GST-P灶的作用． 1.4各組大鼠肝功能的比較：與模型組比較，正肝方小劑量組和大劑量組的ALT、GGT、TBIL值顯著降低(P<0.01或P<0.05)，大劑量組的AST、ALP值也顯

10、著低于模型組(P<0.01或P<0.05)。與小劑量組比較，大劑量組的ALT值顯著低于小劑量組(P<0.01)，表現(xiàn)出一定的量效關系。以上提示：正肝方能保護肝功能，減輕AFB1和2-AAF導致的肝損傷作用。 1.5各組大鼠肝組織PCNA、AFP免疫組化染色結果：正肝方大劑量組PCNA和AFP染色的陽性單位(PU)值較模型組均顯著降低(P<0.01或P<0.05)，大劑量組PCNA和AFP染色的標記指數(shù)(LI)值也低于模型組(P<

11、0.01)。提示大劑量正肝方能有效降低大鼠癌前病變肝組織PCNA和AFP的表達，減輕大鼠癌前病變肝細胞的異常增生． 1.6各組大鼠肝組織Cyclin D1、CDK4表達情況：正肝方小劑量組和大劑量組Cyclin D1染色的LI和PU值較模型組均顯著降低(P<0.01)，大劑量組Cyclin D1染色的PU值也低于小劑量組(P<0.05)，呈現(xiàn)出一定的量效關系；正肝方小劑量組和大劑量組CDK4染色的PU值均較模型組顯著降低，大劑量

12、組PU值也低于小劑量組．正肝方小劑量組和大劑量組的Cyclin D1和CDK4 mRNA表達水平較模型組表達水平均顯著降低(P<0.01)．提示大劑量正肝方能降低大鼠癌前病交肝組織Cyclin D1、CDK4蛋白和mRNA異常高表達水平． 1.7各組大鼠肝組織IGF-Ⅱ表達情況：與模型組比較，正肝方小劑量組和大劑量組的PU值顯著降低(P<0.01或P<0.05)，大劑量組的LI值也低于模型組(P<0.05)．與模型組比較，對照組

13、IGF-ⅡmRNA相對表達水平最低(P<0.01)，正肝方小劑量組和大劑量組的IGF-Ⅱ mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)．與小劑量組比較，大劑量組的IGF-ⅡmRNA表達水平亦顯著低于小劑量組(P<0.01)，呈現(xiàn)出一定的量效關系,提示正肝方能降低大鼠癌前病變肝組織IGF-Ⅱ蛋白和mRNA異常高表達水平。 2.體外血清藥理實驗： 2.1.藥物血清對Bel-7402細胞增殖的影響(MTT比色法)：對照組、正肝方組

14、、維甲酸組A490值分別為1.704±0.102、1.483±0.077、1.510±0.104.與對照組比，正肝方藥物血清組A值顯著降低(P<0.01)。提示正肝方可抑制Bel-7402細胞的增殖。 2.2藥物血清對Bel-7402細胞核質比的影響：對照組、正肝方組、維甲酸組Bel-7402細胞核質比分別為1.04±0.09、0.71±0.07、0.69±0.08.與對照組比，正肝方藥物血清組和維甲酸組核質比顯著降低(P<0.

15、01)．提示正肝方可降低Bel-7402細胞核質比． 2.3藥物血清對Bel-7402細胞分泌AFR的影響：對照組、正肝方組、維甲酸組Bel-7402細胞AFP分泌量(ng/106)分別為22.58±2.68、14.60±1.85、13.50±2.50。與對照組比，正肝方藥物血清組和維甲酸組AFP分泌量顯著低于對照組(P<0.01)，表明正肝方和維甲酸均可抑制Bel-7402細胞分泌AFP。 2.4藥物血清對Bel-74

16、02細胞GGT和ALP活性的影響：與對照組比，正肝方藥物血清組和維甲酸組細胞內GGT活性明顯降低(P<0.05)，ALP活性顯著增高(P<0.01)。提示正肝方可降低Bel-7402細胞內GGT活性，升高ALP活性。 2.5藥物血清對Bel-7402細胞端粒酶活性的影響B(tài)el-7402對照組、正肝方組．A450值分別為0.929±0.066、0.360±0.105.兩者比較，正肝方藥物血清組端粒酶活性顯著低于Bel-7402細胞對照組(