端粒酶特異性核酶抑制A549肺癌細(xì)胞端粒酶活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、端粒酶是含有RNA和蛋白質(zhì)組分的核糖核蛋白。端粒酶RNA為端粒酶合成端粒重復(fù)序列提供了模板，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶是端粒酶的催化亞基。端粒酶能以自身RNA為模板合成端粒重復(fù)序列添加到染色體末端維持端粒長(zhǎng)度從而維持染色體的穩(wěn)定性。研究結(jié)果顯示，端粒酶幾乎在人類各種惡性腫瘤中均有不同程度的表達(dá)，總的表達(dá)率在85％～90％，而在正常人體細(xì)胞幾乎不表達(dá)。由于染色體DNA末端復(fù)制問(wèn)題，正常人體細(xì)胞每分裂一次，端粒就縮短50-200bp,當(dāng)端粒的長(zhǎng)度縮短到

2、一定臨界值后，染色體末端的穩(wěn)定性被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。腫瘤細(xì)胞中由于端粒酶的高表達(dá)維持端粒的長(zhǎng)度使其獲得無(wú)限增殖的能力。鑒于這一特性，端粒酶已被廣泛地應(yīng)用于腫瘤診治的研究。 核酶(ribozyme)是具有酶的催化功能的RNA分子，核酶作為一種特異性抑制轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的工具，已在基因治療和后基因組研究領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用前景。目前主要集中在抗病毒、抗腫瘤的研究上。應(yīng)用核酶技術(shù)來(lái)抑制端粒酶活性從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖不失為腫瘤基因治療

3、的一種有效方法。 本研究通過(guò)設(shè)計(jì)并合成針對(duì)人端粒酶催化亞單位(hTERT)mRNA5’端區(qū)的錘頭狀核酶基因及針對(duì)人端粒酶RNA(hTR)模板區(qū)的錘頭狀核酶基因，分別構(gòu)建表達(dá)hTERT-RZ及hTR-RZ的重組質(zhì)粒，脂質(zhì)體介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)染入人A549肺癌細(xì)胞株，用G418篩選出表達(dá)核酶的細(xì)胞克隆，觀察比較兩種核酶對(duì)人端粒酶活性的抑制效力。對(duì)端粒酶活性下降明顯的細(xì)胞克隆進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞增殖和凋亡的情況，一方面驗(yàn)證以端粒酶為靶點(diǎn)的抗癌治療

4、的可行性，為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供研究基礎(chǔ)；另一方面為核酶用于肺癌的基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 主要研究方法和結(jié)果： 1.分別設(shè)計(jì)并合成針對(duì)端粒酶hTERTmRNA5’端區(qū)的錘頭狀核酶基因及針對(duì)端粒酶RNA模板區(qū)的錘頭狀核酶基因，單鏈通過(guò)退火形成含EcoRI和SalI突出末端的寡核苷酸鏈，并將其分別連接到真核表達(dá)質(zhì)粒pCIneo中構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCIneo-hTERT-RZ及pCIneo-hTR-RZ。通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定證實(shí)

5、插入載體pCIneo中的序列與設(shè)計(jì)的序列完全一致。 2.重組質(zhì)粒pCIneo-hTERT-RZ及pCIneo-hTR-RZ脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染A549肺癌細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pCIneo的A549肺癌細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，未經(jīng)處理的A549肺癌細(xì)胞作為空白對(duì)照組。用G418做穩(wěn)定篩選，篩選出陽(yáng)性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)。每組均獲得許多細(xì)胞克隆，隨機(jī)挑取了轉(zhuǎn)染pCIneo-hTERT-RZ重組體的6個(gè)細(xì)胞克隆(clonehTERT1～6)分別擴(kuò)增培養(yǎng)

6、，轉(zhuǎn)染pCIneo-hTR-RZ重組體的6個(gè)細(xì)胞克隆(clonehTR1～6)分別擴(kuò)增培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染pCIneo質(zhì)粒的細(xì)胞克隆混合培養(yǎng)。 3.利用RT-PCR方法檢測(cè)核酶的表達(dá)，結(jié)果clonehTERT1～6、clonehTR1～6均有核酶的表達(dá)。利用RT-PCR方法檢測(cè)clonehTERT1～6、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組hTERTmRNA的表達(dá)水平，clonehTR1～6、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組hTR的表達(dá)水平。結(jié)果clonehTE

7、RT1～6hTERTmRNA的含量較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組明顯下降，下降最明顯的大約為空白對(duì)照組的12％，clonehTERT1～6hTERTmRNA的平均含量為空白對(duì)照組的30±19％；clonehTR1～6hTR含量較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組下降，下降最明顯的大約為空白對(duì)照組的32％,clonehTR1～6hTR的平均含量為空白對(duì)照組的49±17％。用TRAP法測(cè)定clonehTERT1～6、clonehTR(1、3、5)、陰性對(duì)照組

8、、空白對(duì)照組的端粒酶活性。結(jié)果陰性對(duì)照組端粒酶活性較空白對(duì)照組無(wú)明顯改變；clonehTERT1～6端粒酶活性均下降，其平均端粒酶活性是空白對(duì)照組的27±18％，且與hTERTmRNA的表達(dá)水平一致，clonehTERT1的活性下降最明顯，約為空白對(duì)照組的11％；clonehTR(1、3、5)端粒酶活性也下降，其平均端粒酶活性是空白對(duì)照組的36±13％,clonehTR3活性下降最明顯，約為空白對(duì)照組的22％。MTT法測(cè)定clonehT

9、ERT1、clonehTR3、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，clonehTERT1、clonehTR3生長(zhǎng)較空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組減緩，而clonehTERT1又較clonehTR3生長(zhǎng)慢。Hochest33342染色法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)均證實(shí)clonehTERT1(21.5％)、clonehTR3(16.1％)凋亡率比空白對(duì)照組(2.1％)及陰性對(duì)照組(5.2％)顯著增高。clonehTERT1凋亡率又比clonehTR3的凋亡

10、率高。 結(jié)論： 1.分別設(shè)計(jì)并合成針對(duì)端粒酶hTERTmRNA5’端區(qū)的錘頭狀核酶基因及針對(duì)端粒酶RNA模板區(qū)的錘頭狀核酶基因，構(gòu)建了兩個(gè)錘頭狀核酶表達(dá)重組質(zhì)粒。 2.構(gòu)建的核酶表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后得到的細(xì)胞克隆，均可以檢測(cè)到核酶的表達(dá)。 3.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染核酶重組體的細(xì)胞的端粒酶活性被抑制，細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖變慢，凋亡率增加。 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種核酶對(duì)細(xì)胞端粒酶活性和細(xì)胞增殖的抑制效力不同，