端粒酶亞單位的siRNA對肝癌的作用.pdf

1、華南師范大學碩士學位論文端粒酶亞單位的siRNA對肝癌的作用姓名：楊德華申請學位級別：碩士專業(yè)：植物學指導教師：林德球;金由辛20050601華南師范大學頸士研究生學位論文 端粒酶亞單位的s 1 3 R N A 對肝癌的作用中 文 摘 要肝癌是一種最常見的惡性腫瘤，一直沒有很好的治療方法，目前傾向于化療、基因治療等多種方法聯(lián)合治療，K i m 等用T R A P 法檢測發(fā)現肝細胞中不表達端粒酶活性，而肝癌細胞中則有很高的表達，這從一定程

2、度上表明端粒酶可以作為靶點用于肝癌的診斷和治療。端粒是真核細胞線性染色體末端的結構。對染色體末端起保護作用，端粒的長度與端粒酶活性有關，人類端粒酶由具有催化活性的亞單位( h T E R T ) 、端粒酶模板R N A ( h T R ) 和端粒結合蛋白( h T E P —1 ) 組成，其中h T E R T 和h T R 為端粒酶功能所必需。本文通過R N A 干擾技術特異下調端粒酶亞單位h T R 和h T E R T 基因的表達

3、，研究了s i R N A 下調的效果以及下調以后對端粒酶活性以及肝癌細胞增殖和凋亡的影響，探討了控制人肝癌細胞端粒酶活性的可能性，并為將端粒酶作為抗肝癌新藥靶點提供了初步的實驗依據。針對h T E R T 基因設計并化學合成了三對s i R N A 。另設計了兩對s i R N A ，并通過P C R 擴增法獲得其D N A 表達模板，然后將其亞克隆入p E G F P 載體中。同時針對h T R 基因設計了三對s i R N A ，

4、并用同樣的方法將其模板亞克隆入p E G F P 載體中。用脂質體轉染法將s i R N A 轉染入人肝癌細胞株B e l 一7 4 0 4細胞中，直接合成和載體表達的s i R N A 分別以o l i g o f e c t a m i n 和l i p o f e c t a m i n 2 0 0 0 脂質體進行轉染；熒光顯微鏡檢測s i R N A 表達載體轉染細胞的效率；G - 4 1 8 選擇培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達載體s i

5、R N A 的細胞株；轉染s i R N A 適當天數質以T r i z o l 試劑抽提細胞總R N A ，R T —P C R 檢測基因表達變化，端粒末端重復序列擴增( T R A P ) 法檢測端粒酶活性變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡；R e a l - t i m e P C R 檢測P E G I O 基因表達與h T E R T 基因表達的影響。針對h T E R T 和h T R 基因設計的一共八對s i R N A 均能不