端粒酶亞單位的siRNA對(duì)肝癌的作用.pdf

1、華南師范大學(xué)碩士學(xué)位論文端粒酶亞單位的siRNA對(duì)肝癌的作用姓名：楊德華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：植物學(xué)指導(dǎo)教師：林德球;金由辛20050601華南師范大學(xué)頸士研究生學(xué)位論文 端粒酶亞單位的s 1 3 R N A 對(duì)肝癌的作用中 文 摘 要肝癌是一種最常見(jiàn)的惡性腫瘤，一直沒(méi)有很好的治療方法，目前傾向于化療、基因治療等多種方法聯(lián)合治療，K i m 等用T R A P 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中不表達(dá)端粒酶活性，而肝癌細(xì)胞中則有很高的表達(dá)，這從一定程

2、度上表明端粒酶可以作為靶點(diǎn)用于肝癌的診斷和治療。端粒是真核細(xì)胞線性染色體末端的結(jié)構(gòu)。對(duì)染色體末端起保護(hù)作用，端粒的長(zhǎng)度與端粒酶活性有關(guān)，人類端粒酶由具有催化活性的亞單位( h T E R T ) 、端粒酶模板R N A ( h T R ) 和端粒結(jié)合蛋白( h T E P —1 ) 組成，其中h T E R T 和h T R 為端粒酶功能所必需。本文通過(guò)R N A 干擾技術(shù)特異下調(diào)端粒酶亞單位h T R 和h T E R T 基因的表達(dá)

3、，研究了s i R N A 下調(diào)的效果以及下調(diào)以后對(duì)端粒酶活性以及肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討了控制人肝癌細(xì)胞端粒酶活性的可能性，并為將端粒酶作為抗肝癌新藥靶點(diǎn)提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。針對(duì)h T E R T 基因設(shè)計(jì)并化學(xué)合成了三對(duì)s i R N A 。另設(shè)計(jì)了兩對(duì)s i R N A ，并通過(guò)P C R 擴(kuò)增法獲得其D N A 表達(dá)模板，然后將其亞克隆入p E G F P 載體中。同時(shí)針對(duì)h T R 基因設(shè)計(jì)了三對(duì)s i R N A ，

4、并用同樣的方法將其模板亞克隆入p E G F P 載體中。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將s i R N A 轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞株B e l 一7 4 0 4細(xì)胞中，直接合成和載體表達(dá)的s i R N A 分別以o l i g o f e c t a m i n 和l i p o f e c t a m i n 2 0 0 0 脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染；熒光顯微鏡檢測(cè)s i R N A 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率；G - 4 1 8 選擇培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達(dá)載體s i

5、R N A 的細(xì)胞株；轉(zhuǎn)染s i R N A 適當(dāng)天數(shù)質(zhì)以T r i z o l 試劑抽提細(xì)胞總R N A ，R T —P C R 檢測(cè)基因表達(dá)變化，端粒末端重復(fù)序列擴(kuò)增( T R A P ) 法檢測(cè)端粒酶活性變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；R e a l - t i m e P C R 檢測(cè)P E G I O 基因表達(dá)與h T E R T 基因表達(dá)的影響。針對(duì)h T E R T 和h T R 基因設(shè)計(jì)的一共八對(duì)s i R N A 均能不