TRIM67對胃癌細胞增殖及凋亡影響機制的研究.pdf

1、目的:三結構域蛋白67（TRIM67）是三結構域蛋白家族的其一個成員，它在胃癌中處于沉默或下調的狀態(tài)，目前在胃癌中未見相關文獻，其作用機制尚不明確。我們通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（ Real-time PCR）、蛋白質印跡法（Western blot）及流式細胞術等相關實驗技術驗證TRIM67與胃癌細胞的生長、凋亡等之間的關系。主要闡明該基因在胃癌中作為一個腫瘤抑制基因的生物學功能。
　　方法:
　　1、選取21對香港中文

2、大學威爾斯親王醫(yī)院的胃癌組織和癌旁正常組織樣本為實驗對象，運用實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real-time PCR）測定TRIM67基因在這21對樣本中的表達水平，并分析胃癌組織和癌旁正常組織中TRIM67的表達水平差異。
　　2、運用相關實驗技術，①反轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）驗證TRIM67在胃癌細胞株（AGS、BGC823

3、、MGC803、MKN1、MKN45、MKN74、SNU1、SNU638）中的表達水平；②運用亞硫酸氫鹽測序法（bisulfite genomic sequencing, BGS）對相關胃癌細胞株中TRIM67啟動子序列進行檢測；③應用2uM濃度的5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza）對胃癌細胞株（AGS、BGC823、MKN45、SNU1、SNU638）去甲基化處理96小時后，通過RT-PC

4、R檢測細胞株中的TRIM67的表達水平，并以未用5-Aza處理的對照組進行對比。
　　3、構建 pcDNA3.1-2×Flag-TRIM67重組質粒并轉染胃癌細胞株 AGS和 MKN1，以 pcDNA3.1-vector為對照組，G418篩選出 AGS和 MKN1穩(wěn)定細胞株后，分別以 mRNA和蛋白質水平檢測該胃癌細胞株過表達TRIM67后的表達。運用MTT實驗進一步表明TRIM67對胃癌細胞株細胞生長活力的影響，并通過軟瓊脂克隆

5、形成實驗驗證該基因對胃癌細胞生長及集落形成能力的作用情況。以 TRIM67表達較高的胃癌細胞株MKN74為基礎，應用shRNA（short hairpin RNA）敲低TRIM67并獲得穩(wěn)定細胞株。在mRNA水平檢測轉染該基因的表達情況，并運用MTT實驗和軟瓊脂克隆形成實驗檢測敲低 TRIM67后對胃癌細胞增殖及集落形成的能力。
　　4、以胃癌細胞株AGS和MKN1轉染pcDNA3.1-2×Flag-TRIM67的穩(wěn)定細胞株和 p

6、cDNA3.1-vector對照組的穩(wěn)定細胞株為基礎，用碘化丙啶（PI）對胃癌細胞株進行染色以流式細胞術檢測實驗組和對照組的細胞周期變化，運用Flowjo軟件分析TRIM67基因的與胃癌細胞細胞周期的關系和作用。應用蛋白質印跡法對細胞周期相關蛋白CyclinD1、CDK4、P21和P27進行檢測，以明確TRIM67對細胞周期相關蛋白的作用影響。
　　5、應用 Annexin V和7-AAD（7-amino-actinomycin）

7、雙染過表達TRIM67的胃癌細胞株AGS和MKN1，通過流式細胞術檢驗實驗組和對照組細胞凋亡的情況，對TRIM67基因影響胃癌細胞的凋亡進一步分析。并運用蛋白質印跡法對細胞凋亡的相關蛋白如活化形式的 Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（Poly ADP ribose polymerase, PARP）進行檢測，驗證TRIM67對胃癌細胞凋亡的作用機制。
　　結果

8、:
　　1、胃癌組織及癌旁正常組織中TRIM67的表達變化
　　選取21對胃癌組織及癌旁正常組織對TRIM67基因的mRNA水平的檢測發(fā)現，實驗表明胃癌組織中TRIM67的表達較癌旁正常組織中該基因的表達水平下調（P<0.01, n=21）。
　　2、TRIM67在胃癌細胞株中表達情況及其啟動子甲基化水平的關系
　　我們首先在胃癌細胞株中對TRIM67基因mRNA水平的表達進行檢測，發(fā)現 TRIM67在8個胃癌細

9、胞株中7個細胞株（AGS、BGC823、MGC803、MKN45、MKN1、SNU1、SNU638）的表達沉默或明顯下調，胃癌細胞株 MKN74及人胃粘膜上皮細胞株（GES1）有一定表達水平，在正常胃粘膜上皮組織中表達正常。進而我們用亞硫酸氫鹽測序法測定TRIM67啟動子序列的CpG甲基化位點及甲基化程度。我們發(fā)現7條胃癌細胞株的TRIM67啟動子序列甲基化程度較高，而MKN74和GES1該基因的啟動子序列甲基化程度較低，而在胃正常上皮

10、粘膜組織中未發(fā)現甲基化。我們應用5-Aza對胃癌細胞株（AGS、BGC823、MKN45、SNU1、SNU638）進行去甲基化處理，處理后發(fā)現TRIM67在這5條胃癌細胞株中重新表達或表達上調。
　　3、過表達或下調TRIM67對胃癌細胞生長的影響
　　TRIM67在胃癌細胞株和組織的沉默說明該基因有可能是抑癌基因，我們通過TRIM67在胃癌細胞株中的表達情況，選取胃癌細胞株AGS和MKN1。以 RT-PCR和 Wester

11、n blot analysis以驗證 TRIM67在 AGS和MKN1的轉染效率。過表達TRIM67后，MTT實驗顯示改基因明顯抑制AGS（P<0.0001）和MKN1（P<0.0001）胃癌細胞株的細胞生長活力；同時軟瓊脂克隆形成實驗驗證了TRIM67能夠顯著的抑制AGS（P<0.01）和 MKN1（P<0.01）的細胞生長能力及集落形成能力。為進一步證明TRIM67對胃癌的抑制作用，因此我們運用RNAi技術在TRIM67表達較高的胃

12、癌細胞株 MKN74中敲除該基因，以穩(wěn)定細胞株進行實驗，MTT實驗和軟瓊脂克隆形成實驗證明敲除TRIM67后可促進MKN74細胞的增殖能力（P<0.01）及集落形成能力（P<0.01）。
　　4、胃癌細胞株中TRIM67對細胞周期的作用
　　為確定TRIM67抑制胃癌細胞的生長的機制，我們應用流式細胞術分析了 TRIM67基因對細胞周期的影響。實驗表明在胃癌細胞株中過表達TRIM67能夠明顯增加G1期的細胞數，相反在S期的細

13、胞數是下降的。同時對流式細胞術的結果進行進一步的研究，我們應用 Western blot analysis驗證了過表達TRIM67后對相關細胞周期蛋白的影響，結果顯示該基因能夠抑制CyclinD1和CDK4的表達，并且促進了P21和P27的表達，以阻止細胞周期的進行。
　　5、TRIM67對胃癌細胞凋亡的影響
　　為驗證TRIM67與胃癌細胞凋亡的關系，我們用流式細胞術對過表達TRIM67后的胃癌細胞株（Annexin V和

14、7-AAD雙染）進行凋亡檢測。結果發(fā)現在AGS和MKN1胃癌細胞株中，AGS細胞株中過表達組的總凋亡數要大于空白對照組（P<0.05），在MKN1細胞株中過表達組的早期凋亡數（P<0.001）、晚期凋亡數（P<0.05）大于對照組。同時AGS和MKN1細胞株轉染TRIM67后，促進了細胞凋亡的相關蛋白如活化形式的Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9和PARP的表達以介導細胞凋亡。
　　結論

15、：
　　1、在胃癌組織中TRIM67mRNA表達水平要明顯低于癌旁正常組織。
　　2、TRIM67基因的啟動子序列高度甲基化是導致該基因在胃癌細胞株中表達沉默或下調的重要因素。
　　3、TRIM67基因可能作為一個抑癌基因可以抑制胃癌細胞的增殖和集落形成能力。
　　4研究顯示TRIM67通過抑制cyclin-D1和CDK4并上調P21和P27影響G1/S期阻止細胞周期的進行。
　　5、同時 TRIM67基因