超廣譜β-內(nèi)酰胺酶固定化、動力學特征及標記抗體制備的初步研究.pdf

1、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extendedspectrumβ-lactamase，ESBL）是細菌在超廣譜β-內(nèi)酰胺抗生素選擇壓力下產(chǎn)生的一類耐藥酶，能夠降解大部分青霉素類、三代及三代以下頭孢菌素類的β-內(nèi)酰胺抗生素，主要機制是水解該類抗生素母環(huán)的酰胺鍵而使其失去活性。過去的研究表明，ESBL是一類很好的工具酶，可以被用于清除環(huán)境中殘留抗生素，具有開發(fā)成為抗生素伴侶的廣闊應用前景。本課題一方面通過固定化技術(shù)改善工具酶TEM-116ESBL的催

2、化特性，使重組TEM-116ESBL在清除環(huán)境中殘留抗生素的應用中可重復使用，并提高其穩(wěn)定性。另一方面對CTX-M-14ESBL的動力學特征進行研究，并嘗試以它作為生物大分子標記物制備酶標記抗體，為將它開發(fā)成一種新的工具酶奠定基礎(chǔ)。過程如下：
　　 1、活化、鑒定產(chǎn)TEM-116ESBL的BL21(DE3)工程菌，表達、純化重組TEM-116酶，以戊二醛為交聯(lián)劑將它固定于殼聚糖微球載體，并采用單因素輪換法和響應曲面法對固定化條件

3、進行優(yōu)化。結(jié)果表明，4℃條件下，當戊二醛濃度0.54％、交聯(lián)pH5.4、給酶量0.58IU/g殼聚糖微球、固定化pH6.2時，固定化酶的酶活和回收率分別可達到0.49IU/g和84％(0.49IU/0.58IU)。與游離酶相比，固定化酶的酸堿穩(wěn)定性和可重復利用性得到顯著提高，在pH5.8-7.4范圍內(nèi)酶活性保持在73％-100％的水平，經(jīng)7次重復性使用（1h/次），酶活力保留高達80％。
　　 2、以攜帶CTX-M-14基因的E

4、.coli臨床株為模板，克隆目的基因，重組工程菌，并表達CTX-M-14ESBL。進而采用基于重疊延伸PCR法的定點突變技術(shù)，將CTX-M-14ESBL的167位點Pro(P)分別突變?yōu)镚ly(G)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)，重組構(gòu)建P167G、P167Q、P167S和P167T四株突變型的CTX-M-14工程菌。表達與純化野生型、重組型和突變型CTX-M-14ESBL，檢測其水解β-內(nèi)酰胺類抗菌素的酶動力學參數(shù)(Kca

5、t、Km和Kcat/Km)。結(jié)果顯示野生型與重組型CTX-M-14的酶動力學參數(shù)Kcat(t=1.796，p=0.123)、Km(t=0.559，p=0.596)、Kcat/Km(t=0.893，p=0.406)間的差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.1)。與重組型CTX-M-14相比，P167S突變型酶對頭孢他定的Kcat值大幅降低，為突變前的1/16(8.39/134.85);Kcat和Kcat/Km值分別為突變前的2.87倍(1.81/0.

6、63)和43.6倍(0.218/0.005)；且對青霉素、氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢曲松和頭孢噻肟的Kcat/Km值都呈現(xiàn)出顯著減小的趨勢(p＜0.05)。與重組CTX-M-14ESBL相比，P167Q和P167G突變型酶對頭孢他定的Kcat值亦大幅減小(Kcat＜0.01)，而P167T突變型對頭孢他定的酶動力學參數(shù)無明顯變化。
　　 3、分別采用戊二醛一步法、二步法、二步改良法和碳化二亞胺法制備CTX-M-14酶標記