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文檔簡介
1、隨著抗菌藥長期廣泛使用,腸桿菌科雞源分離菌對藥物的耐藥率逐年升高,且呈多重耐藥趨勢。導致細菌獲得多重耐藥的因素有很多,其中超廣譜β-內酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases,ESBLs)和整合子被證實常參與細菌多重耐約的形成。為此,做了以下研究:
(一)利用VITEK-32全自動細菌鑒定儀對從河南省14個地市不同養(yǎng)雞場分離的64株雞源分離菌進行鑒定,獲得51株雞源大腸桿菌、8株雞源沙門菌、4株雞
2、源奇異變形桿菌和1株雞源鮑曼不動桿菌,其中雞源鮑曼不動桿菌為國內外首次分離。采用微量稀釋法測定64株雞分離菌對p-內酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類、氟喹諾酮類和磺胺等六類共24個藥物或組合的多重耐藥表型。結果發(fā)現58.8%~74.5%的雞源大腸桿菌對三代頭孢耐藥,96%(49/51)為四重及以上耐藥菌株,92.2%(47/51)呈五重及以上耐藥,82.4%(42/51)呈六重及以上耐藥。8株雞源沙門菌的多重耐藥譜均不低于四重,且
3、其中兩株菌呈現出同時耐12重藥物。其他五株分離菌的耐藥譜均低于3重(其中Dpro為五重耐藥除外),且均對三代頭孢敏感。
(二)ESBL檢測結果表明54.7%(35/64)受試菌為產ESBL菌。利用PCR法檢測64株受試菌攜帶β-內酰胺酶基因情況,結果發(fā)現38株攜帶TEM基因,包括TEM-1亞型37株,TEM-57亞型1株,其中TEM-57亞型為首次在雞源分離菌中檢出。19株攜帶CTX-M基因,包括14株CTX-M-65,1
4、株CTX-M-14,3株CTX-M-24和1株CTX-M-90,其中CTX-M-90為首次發(fā)現并命名的一個新基因亞型,CTX-M-65亞型為首次在動物源分離菌中檢出。由此得出CTX-M基因突變過程為CTX-M-14→CTX-M-24或CTX-M-90→CTX-M-65。21株攜帶OXA基因,包括11株OXA-1,2株OXA-2和16株OXA-10。說明TEM-1是目前河南省養(yǎng)雞場雞源分離菌中的主要基因亞型,其次為OXA-10、CTX-M
5、-65和OXA-1。
(三)分析產ESBL菌和非產ESBL菌攜帶β-內酰胺酶基因情況和多重耐藥譜。結果發(fā)現74.3%產ESBL菌(26/35)同時攜帶兩種以上β-內酰胺酶基因,而僅6.9%(2/29)非產ESBL菌同時檢出2種β-內酰胺酶基因。在35株產ESBL菌中,100%耐氨芐西林,對三代頭孢的耐藥率為77.1%~91.4%,對三代頭孢/酶抑制劑聯用的耐藥率為0~37.1%,同時,產ESBL菌的多重耐藥譜均不低于六重,
6、其中94.3%(33/35)為七重及以上耐藥菌株。而非產ESBL菌對β-內酰胺類的耐藥率均低于45%(氨芐西林除外),44.8%(13/29)的多重耐藥譜不低于6重,僅20.7%(6/29)不低于七重。比較產酶菌ESBL基因型與多重耐藥譜關系后發(fā)現47.4%(9/19)產CTX-M-ESBL菌多重耐藥譜不低于十重,而在16株非產CTX-M-ESBL菌中,僅18.8%(3/16)不低于十重。同時還發(fā)現在15株產CTX-M-65或CTX-M
7、-90菌株中,60%(9/15)多重耐藥譜超過10重,20%(3/15)為12重;而4株攜帶CTX-M-14或CTX-M-24菌株多重耐藥譜均低于10重。即攜帶CTX-M-65或CTX-M-90的菌株對受試藥物耐藥性較攜帶CTX-M-14或CTX-M-24菌株嚴重,提示CTX-M基因亞型的突變趨勢與細菌耐藥表型擴大延伸方向基本一致。
(四)采用1/2MIC頭孢曲松或頭孢噻肟誘導培養(yǎng)5株非產ESBL雞源大腸桿菌和O78。結果
8、發(fā)現培養(yǎng)至10代時,頭孢曲松或頭孢噻肟的MIC值升高了8~64倍;培養(yǎng)至20代時,兩藥的MIC值又升高了2~16倍,其中頭孢噻肟誘導的O78已對頭孢噻肟耐藥;培養(yǎng)至30代時,誘導菌對頭孢曲松、頭孢噻肟、慶大霉素、阿米卡星、多西環(huán)素、氟苯尼考和恩諾沙星均耐藥。說明在單一抗菌藥定向選擇性壓力下,細菌表達多重耐藥表型的速度是較快的。
(五)經PCR檢測及測序分析,未誘導前O78為TEM-1型,頭孢噻肟誘導至20代時,TEM序列發(fā)
9、生一處堿基變異(24T→C);誘導至30代時,TEM-1序列發(fā)生兩處堿基變異(24T→C,40C→T),其中后一處堿基突變引起14Pro→Ser,即TEM-1基因可直接突變?yōu)橐粋€新基因亞型,說明藥物定向誘導對菌株TEM基因變異起了重要作用。未誘導前,受試菌均不攜帶CTX-M基因,誘導至20代時,頭孢噻肟誘導O78已突變?yōu)镃TX-M-14-ESBL菌株;誘導至30代時,所有誘導菌株均成為CTX-M-ESBL(CTX-M-90和CTX-M-
10、65)菌株,說明在三代頭孢定向選擇性壓力下,CTX-M型基因具有較快變異速度。分析各CTX-M基因序列推斷出CTX-M基因突變過程:非產ESBL菌首先獲得CTX-M-14基因,接著該基因發(fā)生氨基酸點突變成為CTX-M-90,然后CTX-M-90基因進一步積累氨基酸點突變,菌株獲得CTX-M-65基因,隨著誘導的深入,CTX-M-65基因也開始出現堿基突變,但由于該突變僅為沉默突變,故暫時未有新基因亞型產生。此外,本誘導試驗獲得的CTX-
11、M基因亞型均在前期雞源分離菌檢測時有檢出,說明本誘導試驗的推斷出的CTX-M基因突變過程可在一定程度上反映出臨床菌實際的突變過程,誘導藥物與臨床菌實際接觸的藥物相似。
(六)利用PCR技術檢測51株雞源大腸桿菌中整合子流行情況。結果表明86.3%(44/51)檢出Ⅰ類整合子,3.9%(2/51)檢出Ⅱ類整合子,未檢出Ⅲ類整合子和非典型Ⅰ類整合子。基因盒插入區(qū)片段經克隆、測序和比對后發(fā)現在44株Ⅰ類整合子中耐藥基因盒組合類型
12、包括sat(100%)、dfrA1/aadA1(45.4%)、dfrA17/aadA5(22.5%)、dfrA1/sat/aadA2(6,8%)和約4800bp的未知基因盒(27.3%),其中dfrA1/sat/aadA2基因組合為國內外首次報道。進一步采用巢式PCR和PCR定位技術檢出4800bp未知基因盒內含有blacTX-M基因,且該基因位于基因盒區(qū)的中下游。兩株Ⅱ類整合子陽性菌中檢出的耐藥基因盒組合均為dfrA1/sat1/aa
13、dA1。
(七)分析雞源大腸桿菌整合子與ESBL的關系后發(fā)現93.6%產ESBL雞源大腸桿菌(29/31)攜帶整合子,而在20株非產ESBL雞源大腸桿菌中,此數值為75%,兩組之間的差異具有統計學意義,說明整合子在產ESBL雞源大腸桿菌中分布更為集中。在15株攜帶整合子的非產ESBL菌中,80%菌株(12/15)攜帶一種整合子,且整合子的可變區(qū)僅整合了一種耐藥基因;而對29株攜帶整合子的產ESBL菌來說,有89.6%菌株(
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