基于狂犬病毒標記神經環(huán)路單細胞測序系統(tǒng)的建立及應用.pdf

1、狂犬病毒是一種致死性的神經嗜性病原微生物，由于其很高的致死率以及目前缺乏很好的防治方法，對人類和相關宿主動物的健康造成了巨大的威脅，也因此成為了病原學中一個很重要的研究對象。另一方面因其具有對神經元的特殊嗜性以及在神經元內生存和復制的能力，狂犬病毒被開發(fā)成為了一種用來神經環(huán)路示蹤和標記的有力工具，相對于傳統(tǒng)的神經環(huán)路示蹤工具有著天然優(yōu)勢，在神經科學的研究中具有巨大的應用價值和開發(fā)潛力。單細胞測序技術作為近幾年發(fā)展起來的新型技術，憑借其獨

2、有的優(yōu)勢為現(xiàn)代生物學的發(fā)展起到了巨大的推動作用，通過對單個細胞組學相關信息的分析實現(xiàn)在細胞和分子層析探索相關生物學過程以及復雜組織的結構和功能的解析，在發(fā)育、癌癥以及神經科學等研究領域具有不可替代的應用潛力。
　　大腦，作為目前動物體中結構和功能最復雜的器官，已成為現(xiàn)在生命科學和醫(yī)學研究領域最熱門也最有挑戰(zhàn)性的領域，對其深入的研究和探索對理解大腦運行機制以及對相關腦疾病的防治提供理論意義和指導作用。而對于大腦奧秘的揭示，最重要的一

3、步是對其中數(shù)量龐大而又錯綜復雜神經環(huán)路結構和功能的解析。
　　于是，基于以上相關技術和科學背景，本課題主要的目的是利用狂犬病毒對特異神經環(huán)路進行示蹤和標記，描繪對應神經環(huán)路的結構基礎，同時結合單細胞測序技術對標記的特異神經環(huán)路上的神經元進行單細胞水平上的轉錄組分析，分析對應神經環(huán)路的功能基礎。從而實現(xiàn)對特定神經環(huán)路結構和功能的解析，為進一步深入探索神經環(huán)路的調節(jié)機制以及在受到外界病原入侵時如何變化提供科學基礎和研究思路。本課題的研

4、究內容主要分為以下幾個方面:
　　1.片段化酶Tn5的純化和應用
　　Tn5是來源于大腸桿菌中一種轉座酶，由于其在體外可以轉座以及對DNA片段進行切割和連接接頭的能力被開發(fā)為二代測序文庫構建時用于片段化和接頭化的工具酶，并在單細胞測序文庫構建中具有很廣泛的應用價值。在該課題中，我們首先對其進行了表達、純化和組裝。其次對其進行了活性檢測，驗證了Tn5具有DNA片段化和加接頭的能力。最后我們經過不斷優(yōu)化反應條件將其成功應用到單細

5、胞轉錄組測序Smart-seq2建庫方法中，節(jié)省建庫成本的同時又可以進行特殊功能應用的擴展。
　　2.Smart-seq2技術在培養(yǎng)細胞和特異神經環(huán)路神經元上的應用
　　Smart-seq2技術是目前最常用的單細胞RNA-seq技術，我們首先通過不斷地嘗試和摸索將其應用到培養(yǎng)的細胞上，做到了個位數(shù)細胞起始量的轉錄組擴增。然后結合狂犬病毒對特異神經環(huán)路神經元的標記和分離技術，將其應用到特異神經環(huán)路神經元上，完成了對神經環(huán)路單個

6、神經元轉錄組的建庫測序和數(shù)據(jù)分析，從而實現(xiàn)對感興趣的特定神經環(huán)路結構的解析和功能的探索。
　　3.PVN-LHA神經環(huán)路的標記和初步探索
　　PVN是下丘腦中具有調節(jié)機體相關自主性的生理功能作用的神經核團，PVN-LHA神經環(huán)路對于機體飲食的調節(jié)起著直接的影響，對其深入的研究可以理解大腦對飲食行為的調節(jié)機制以及在受到病原入侵時的響應。本課題中，我們首先利用GFP重組的狂犬病毒對PVN-LHA環(huán)路進行了標記，然后對在PVN處標

7、記的神經元進行了單細胞轉錄組測序實驗。我們分析了這些神經元的基因表達譜，并對神經元類型和功能相關的基因表達情況做了免疫組化方面的驗證，為進一步深入研究提供了數(shù)據(jù)基礎。
　　總體而言，本課題結合狂犬病毒對特異神經環(huán)路的示蹤標記技術和單細胞RNA-seq技術，實現(xiàn)了在特定神經環(huán)路上神經元單細胞轉錄組分析技術的建立，并將其應用到PVN-LHA神經環(huán)路，初步鑒定了該環(huán)路PVN處神經元的類型和功能，為進一步研究此環(huán)路提供了一定的技術，而且這