重金屬汞、銅、鉛、鎘的酶聯(lián)免疫吸附快速檢測方法研究.pdf

1、隨著近年來工農(nóng)業(yè)的迅猛發(fā)展，環(huán)境中的重金屬污染日趨嚴重。重金屬污染問題受到了人們普遍關(guān)注，而重金屬檢測分析和監(jiān)測的機構(gòu)承擔(dān)的相關(guān)任務(wù)越來越重，對檢測的質(zhì)量和速度要求也越來越高。目前重金屬的檢測方法主要以原子吸收等儀器分析為主，這些方法可實現(xiàn)準確、較靈敏地定量分析，但其不足之處在于樣品前處理過程復(fù)雜、儀器配置要求高、價格昂貴、花費較大、周期偏長等。因此，建立簡便、可靠、快速有效的重金屬檢測分析方法，用于定量檢測環(huán)境介質(zhì)中的重金屬，具有重要

2、的研究意義和實用價值。
　　本文以研究建立快速檢測環(huán)境中四種重金屬（汞、銅、鉛、鎘）的酶聯(lián)免疫分析（ELISA）方法為目標，設(shè)計合成了這四種重金屬的半抗原，并通過結(jié)合載體蛋白合成人工抗原，然后免疫動物獲得了相關(guān)特異性抗體，基于制備的抗體，研究確立了四種重金屬的間接競爭酶聯(lián)免疫分析（IC-ELISA）方法。所建立的方法為重金屬的快速檢測提供了技術(shù)手段，并具一定的推廣應(yīng)用前景。主要研究結(jié)果如下：
　　1．以青霉素G鈉鹽和谷胱甘肽

3、作為中間化合物，分別合成重金屬汞的半抗原青霉烯酸硫醇汞鹽（Hg-MPA）和汞-谷胱甘肽（Hg-GSH），將載體蛋白與半抗原偶聯(lián)的方法選擇碳二亞胺法，制備人工抗原（青霉烯酸硫醇汞鹽-牛血清白蛋白(Hg-MPA-BSA），青霉烯酸硫醇汞鹽-卵清蛋白（Hg-MPA-OVA）和汞-谷胱甘肽-牛血清白蛋白（Hg-GSH-BSA）。分別通過紫外光譜掃描、紅外光譜、圓二色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、三硝基苯磺酸鈉法（TNBS）、考馬斯

4、亮藍法（Bradford法）和電感耦合等離子發(fā)射光譜法（ICP-AES）表征驗證了其分子結(jié)構(gòu)。然后將人工抗原 Hg-MPA-BSA和Hg-GSH-BSA分別免疫新西蘭大白兔制得重金屬汞多克隆抗體，對抗血清進行效價測定，抗血清最終效價均在1：32000以上。將制備的多克隆抗血清用于研究建立重金屬汞的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法，優(yōu)化并確立最佳ELISA分析條件。以抗原Hg-MPA-BSA制備的抗體最適抗原-抗體反應(yīng)條件為：包被抗原2.0μg/

5、mL，抗體稀釋度1：10000；以抗原Hg-GSH-BSA制備的抗體最佳抗原-抗體反應(yīng)條件為：包被抗原2.5μg/mL和抗體稀釋度1：8000。最終確立的最佳包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液（CB，pH9.6）；二抗最佳稀釋度為1：5000；選擇5％甘氨酸作為封閉液。以抗原Hg-MPA-BSA制備的抗體構(gòu)建IC-ELISA，以作為抑制物的汞標準溶液對數(shù)值為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制得IC-ELISA檢測重金屬汞的標準曲線，用直線擬合后得回歸方

6、程y=37.38x-30.85，相關(guān)系數(shù)為0.9869，汞的檢測范圍為0.01μg/mL~100μg/mL，檢測下限為12.30 ng/mL，水樣中重金屬汞的加標回收率為76.0%～124.0%，與ICP-AES方法檢測結(jié)果準確度相當(dāng)。特異性試驗表明，除了與鎘存在較低的交叉反應(yīng)率外，與其他金屬離子（Cu2+、Pb2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+）交叉反應(yīng)率都小于0.001%。
　　2．以青霉素G鈉鹽為中間化合

7、物，合成重金屬銅的半抗原（青霉烯酸硫醇銅鹽(Cu-MPA），將半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)，制備人工抗原（青霉烯酸硫醇銅鹽-牛血清白蛋白(Cu-MPA-BSA）和青霉烯酸硫醇銅鹽-卵清白蛋白(Cu-MPA-OVA），采用紫外、紅外光譜、圓二色譜和電感耦合等離子發(fā)射光譜等方法，表征鑒定抗原結(jié)構(gòu)；然后用該人工抗原免疫新西蘭大白兔獲得重金屬銅多克隆抗體，血清的效價最高達1：128000。將該抗體用于建立重金

8、屬銅的IC-ELISA檢測方法，并優(yōu)化確立最佳ELISA檢測條件。確立最佳包被抗原濃度為2.0μg/mL，抗體稀釋度為1：8000，最佳包被緩沖液為碳酸鹽緩沖液（CB，pH9.6），5%甘氨酸作為封閉液，二抗最佳稀釋度為1：5000。以銅標準溶液對數(shù)值為橫坐標，抑制率為縱坐標繪制得間接競爭ELISA法檢測重金屬銅的標準曲線，用直線擬合后得回歸方程y=22.10x-9.01，相關(guān)系數(shù)為0.9768，銅的檢測范圍為0.01μg/mL~100

9、μg/mL，檢測下限為7.29 ng/mL。加標回收率試驗結(jié)果表明，IC-ELISA方法檢測水溶液中銅的加標回收率在78.0%～122.0%。交叉反應(yīng)試驗結(jié)果，該方法與其他測試金屬離子（Hg2+、Cd2+、Pb2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+和Ni2+）的交叉反應(yīng)率均低于0.1%，表明該方法具有很高的的特異性。
　　3．以p-NH2-Bn-DTPA為雙功能螯合劑，戊二醛為交聯(lián)劑，偶聯(lián)p-NH2-Bn-DTPA和載體蛋白

10、鑰孔戚血藍素(KLH)，然后與鉛和鎘離子進行螯合反應(yīng)，制備重金屬鉛和鎘的人工抗原（Pb-p-NH2-Bn-DTPA-KLH和Cd-p-NH2-Bn-DTPA-KLH）。經(jīng)紫外光譜、紅外光譜、圓二色譜、SDS-PAGE和電感耦合等離子發(fā)射光譜等技術(shù)表征鑒定。以制備的人工抗原免疫BALB/c小鼠，獲得重金屬鉛和鎘的多克隆抗體，血清的效價分別大于1：20000和1：10000。在優(yōu)化確定IC-ELISA的工作條件后建立鉛和鎘的IC-ELISA

11、檢測方法。在最佳條件下檢測鉛和鎘，標準曲線直線擬合后得鉛的回歸方程為y=29.81x-14.49，相關(guān)系數(shù)為0.9736，鎘的回歸方程為y=36.93x-33.41，相關(guān)系數(shù)為0.9918。鉛和鎘的檢測范圍為0.01μg/mL~100μg/mL，鉛的檢測下限為6.63 ng/mL，鎘的檢測下限為14.98 ng/mL。加標回收率試驗結(jié)果表明，鉛和鎘的IC-ELISA方法的添加回收率分別為79.4%～126.0%和86.2%～144.0%

12、。交叉反應(yīng)試驗結(jié)果，鉛的IC-ELISA方法與其他的供試金屬（Cu2+、Cd2+、Hg2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Ni2+）交叉反應(yīng)率都小于0.001%；鎘的IC-ELISA方法除了汞有5.8%的交叉反應(yīng)率外，其他的供試金屬交叉反應(yīng)率也都小于0.001%，方法的特異性較好。
　　建立的四種重金屬（汞、銅、鉛和鎘）的酶聯(lián)免疫分析（IC-ELISA）方法，具有高靈敏、高通量、高特異和操作簡便等優(yōu)點。水中樣品IC-EL