低劑量輻射對小鼠骨髓、肝及脾DNA甲基化的影響.pdf

1、隨著放射醫(yī)學在臨床診療應用的推廣和普及以及核電事業(yè)的發(fā)展，人們受到的輻射危害也逐漸增加。雖近年來人們對輻射生物學效應研究逐年增多，但主要集中在高劑量輻射，對低劑量輻射關注較少，這使得人們對低劑量輻射效應缺乏足夠的了解和科學的認識。低劑量輻射雖不會對機體造成明顯的傷害，但并不意味著低劑量輻射對機體沒有危害。
　　輻射可對機體多種組織器官造成損傷，如骨髓的造血組織，消化系統(tǒng)的肝臟及免疫系統(tǒng)的脾臟，它們均對輻射較為敏感。既往研究顯示輻射

2、可導致骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cell，BMNC)DNA受損，凋亡率增加，骨髓增殖能力降低，使骨髓造血干細胞數(shù)量迅速減少，最終導致血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生，如白血病。同時輻射也可導致肝臟的損傷[1]。Gridley等人研究同樣發(fā)現(xiàn)無論何種類型輻射都會導致免疫力下降及脾臟細胞的異常[2]。
　　表觀遺傳學是指不涉及DNA序列改變的基因表達變化。它的主要調(diào)控方式包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑

3、和非編碼RNA等。目前人們關注較多的是DNA甲基化，DNA甲基化是指由DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化，將活性甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉移至胞嘧啶，從而使胞嘧啶轉變?yōu)?-甲基胞嘧啶的化學反應過程。DNA甲基化發(fā)生在胞嘧啶殘基，主要是胞嘧啶-磷酸二酯-鳥嘌呤(cytosine-phosphate diester-guanine，CpG)二核苷酸部位，哺乳動物體內(nèi)的CpG以兩種形式存在，一種是分散于

4、DNA中，另一種是位于轉錄調(diào)控區(qū)附近的CpG島。它不僅可穩(wěn)定或鎖定靜息部位染色體的狀態(tài)，還對基因印記、X染色體失活、反轉錄轉座子的抑制以及動物的正常發(fā)育都是必不可少的。1989年，Kalinich等人的研究發(fā)現(xiàn)γ射線可使一些細胞系的甲基化胞嘧啶還原為胞嘧啶[3]。1998年，Tawa等人同樣報道輻射可導致體內(nèi)外全基因組甲基化程度的降低[4]。2013年，Antwih等人報道輻射可影響細胞DNA甲基化[5]。但是以上研究均采用的是高劑量輻

5、射，低劑量輻射與DNA甲基化效應仍不清楚。2004年，Kovalchuk等人的研究發(fā)現(xiàn)低劑量輻射可導致DNA甲基化水平的改變，且具有組織特異性和器官特異性[6]，但有關低劑量輻射對DNA甲基化影響的研究報道仍相對較少，其與DNA甲基化的關系并不十分清楚。本研究擬通過觀察低劑量輻射對小鼠骨髓、肝臟和脾臟生物學效應的影響，尤其是DNA甲基化的影響，為輻射防護提供新的研究思路。
　　目的:研究低劑量輻射對急性放射損傷小鼠外周血計數(shù)，BM

6、NC增殖能力與凋亡率，肝、脾組織學結構，脾指數(shù)，肝、脾及BMNC全基因組DNA甲基化水平及DNA甲基轉移酶(DNAmethyltransferase，DNMTs）表達的影響，進而觀察急性低劑量輻射對小鼠生物學效應的影響。
　　方法:
　　1.將C57BL/6小鼠隨機分為5組，每組25只，正常組（不做任何處理）;輻射組（按輻射后提取標本時間分為1、3、7及14 d組）。輻射組采用直線加速器全身均勻照射，總劑量為1.0 Gy,時

7、間為0.39 min，X射線吸收劑量率為300 cGy/min，有效面積為25 cm2，焦點-鼠距為100cm。并于不同時間點眼眶取血，取血后頸椎脫臼處死小鼠，常規(guī)方法提取BMNC、肝臟及脾臟。
　　2.常規(guī)進行外周血WBC，RBC及PLT計數(shù)。
　　3.CCK8法檢測BMNC增殖能力。
　　4.流式細胞術檢測BMNC凋亡率。
　　5.制備肝臟組織學切片并光學顯微鏡觀察。
　　6.計算脾指數(shù)及制備脾臟組織學

8、切片并光學顯微鏡觀察。
　　7.高效液相色譜儀檢測肝、脾及BMNC全基因組DNA甲基化水平。
　　8.WB(western blot)檢測BMNC DNMT1、DNMT3A及DNMT3B的表達。
　　9.WB檢測肝臟DNMT1、DNMT3A及DNMT3B的表達。
　　10.WB檢測脾臟DNMT1、DNMT3A及DNMT3B的表達。
　　結果:
　　1.與正常組相比，輻射組小鼠毛發(fā)光澤、活動度、食量及飲

9、水量均與正常小鼠無異，大便無異常，14d內(nèi)無小鼠死亡。
　　2.與正常組相比，輻射組白細胞及血小板計數(shù)均明顯降低(P＜0.05），白細胞在1d時降至最低，而血小板在3d時降至最低，14d仍未恢復正常。
　　3.與正常組相比，輻射組小鼠BMNC增殖能力升高(P＜0.05),14d時恢復正常。
　　4.與正常組相比，輻射組小鼠BMNC凋亡率3d開始升高(P＜0.05），14d恢復正常。
　　5.光鏡結果顯示，與正常組

10、相比，輻射組小鼠肝小葉結構完整，病變多發(fā)生在中央靜脈附近，肝細胞水腫、空泡變，局部肝細胞壞死，少許細胞脂肪變，血竇被擠壓變窄，尤以3d和7d時最為嚴重，14d略有好轉，但未恢復至正常。
　　6.與正常組相比，輻射組小鼠脾指數(shù)在1d時即顯著降低，7d恢復正常。光鏡結果顯示，正常組小鼠脾臟白髓與紅髓分界清楚，淋巴細胞排列緊密，輻射組小鼠脾臟出現(xiàn)淤血，部分小血管玻璃樣變性，血管內(nèi)皮細胞腫脹，尤以3d組最為嚴重，7d時逐漸好轉，14d時恢

11、復正常。
　　7.與正常組相比，輻射組BMNC、肝及脾全基因組DNA甲基化水平下降(P＜0.05），但BMNC和肝分別在14d及3d恢復正常，脾臟在14d仍未恢復正常。
　　8.與正常組相比，輻射組BMNC DNMT1及DNMT3A表達顯著升高(P＜0.05），14 d時仍未恢復至正常，DNMT3B的表達也顯著升高(P＜0.05），但在7d時已恢復至正常。
　　9.與正常組相比，輻射組肝臟DNMT1及DNMT3A表達顯

12、著升高(P＜0.05），14d時仍未恢復至正常。DNMT3B的表達也顯著升高(P＜0.05)，但在7d時已恢復至正常。
　　10.與正常組相比，輻射組脾臟DNMT1及DNMT3A表達顯著降低(P＜0.05)，DNMT3B未檢測出，DNMT114d時仍未恢復正常，DNMT3A在7d時已恢復至正常。
　　結論:1）單次1Gyx射線照射可導致小鼠BMNC凋亡率及增殖能力的增高，全基因組DNA甲基化水平的降低及DNA甲基轉移酶表達的