DNA甲基化對兔骨髓間充質(zhì)干細胞向胰島細胞分化影響的研究.pdf

1、糖尿病已成為嚴重危害人類健康的重大疾病之一，到目前為止，仍然沒有理想的治療方法。胰島細胞移植治療1型糖尿病和部分2型糖尿病的相關(guān)研究取得了很大進展。但供體不足及免疫排斥反應嚴重阻礙胰島細胞移植的推廣應用。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)是一類具有自我增殖和多向分化潛能的成體干細胞。在適當?shù)恼T導條件下，可以跨胚層分化為內(nèi)胚層的胰島細胞。然而如何高效而定向的誘導分化仍然是一個

2、大的挑戰(zhàn)。胰島細胞分化的機制是由一系列胰腺發(fā)育過程的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控完成的。DNA甲基化水平參與組織特異性基因的調(diào)控，從而參與干細胞分化。本試驗在優(yōu)化分離培養(yǎng)兔BMSCs方法的基礎上，研究甲基化抑制劑5-aza-dC對兔BMSCs向胰島細胞分化的作用和適宜濃度，探討DNA甲基化水平與胰島β細胞分化的關(guān)系，為進一步研究和臨床應用提供理論依據(jù)。
　　1.本試驗采用紅細胞裂解法分離兔BMSCs，利用全骨髓法的原理對BMSCs進行培養(yǎng)，優(yōu)化傳

3、代條件和接種密度，免疫細胞化學法鑒定BMSCs表面標志，細胞計數(shù)法測定第3代和第8代兔BMSCs生長曲線并計算群體倍增時間，得出采用上述方法分離培養(yǎng)兔BMSCs，能夠得到細胞純度高，活力強的BMSCs。
　　2.本試驗采用MTT法檢測甲基化抑制劑5-aza-dC對兔BMSCs細胞活力的影響，篩選出作用兔BMSCs適宜的5-aza-dC濃度為0.2-1μmol/L。采用5-aza-dC(1μ mol/L，96h)對兔BMSCs進行誘

4、導前期處理，與未添加5-aza-dC的誘導組進行形態(tài)學對比、雙硫腙染色鑒定胰島素分泌對比、免疫熒光鑒定PDX-1蛋白表達對比。結(jié)果表明應用甲基化抑制劑5-aza-dC聯(lián)合DMSO、尼克酰胺、高糖誘導后的BMSCs具備分泌胰島素的能力、并表達胰島細胞的特異標志，表明甲基化抑制劑5-aza-dC能夠促進胰島細胞的分化和β細胞成熟。
　　3.本試驗在試驗二的基礎上對應用甲基化抑制劑5-aza-dC處理的誘導后胰島細胞，通過提取RNA，然