DNA甲基化對(duì)雌性山羊初情期啟動(dòng)的影響.pdf

1、本試驗(yàn)首先探討初情期前與初情期山羊下丘腦DNMTs和MBPs mRNAs以及全基因組DNA甲基化水平的變化，篩選出在初情期啟動(dòng)中受DNA甲基化調(diào)控的候選基因，繼而分析其在初情期啟動(dòng)中的功能，為深入理解動(dòng)物初情期啟動(dòng)機(jī)制提供科學(xué)的理論依據(jù)。
　　取初情期前（2.5～3M，體重9.60±2.36kg）和初情期(4.5～5M，體重17.43±1.63kg)的雌性山羊下丘腦組織，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)DNMTs和MBPsmRNAs的表

2、達(dá)變化;通過全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序(Whole-genome bisulfite sequencing，WGBS)對(duì)下丘腦DNA甲基化水平進(jìn)行分析，從而得出其全基因組甲基化譜。比較初情期前和初情期不同基因的甲基化水平變化，結(jié)合GO和KEGG通路分析篩選出參與初情期啟動(dòng)調(diào)控的候選基因群。體外原代培養(yǎng)下丘腦神經(jīng)細(xì)胞，通過siRNA干擾的方法降低侯選基因表達(dá)，研究其對(duì)GnRH、GnIH和KISS1mRNA的表達(dá)影響。所得試驗(yàn)結(jié)果如下:

3、　　(1)從初情期前到初情期，山羊下丘腦中DNMT1、MBD2以及MeCP2mRNA的表達(dá)顯著上升（P＜0.05)，DNMT3A和MBD3mRNA顯著下降（P＜0.05），DNMT3B和MBD1mRNA則無顯著變化（P＞0.05）。(2)初情期山羊下丘腦甲基化主要發(fā)生在CG位點(diǎn)，全基因組甲基化呈現(xiàn)出一種高甲基化狀態(tài)，但在初情期前和初情期基本保持不變。(3)在各個(gè)染色體中，其甲基化水平在兩個(gè)時(shí)期也呈現(xiàn)出相似的狀態(tài)。在不同的基因功能區(qū)域，5

4、'URT和內(nèi)含子的甲基化水平最低，外顯子甲基化水平最高，并且在啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平和甲基化密度均呈現(xiàn)逐漸降低的模式。(4)通過甲基化差異區(qū)域分析，獲得267個(gè)差異甲基化區(qū)域(DMR)，長(zhǎng)度均分布在2000bp以內(nèi)。在初情期前與初情期，DMR的甲基化水平均處于低水平狀態(tài)。甲基化差異基因分析發(fā)現(xiàn)，基因甲基化升高的有55個(gè)，降低的有62個(gè)，且甲基化主要發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域。通過GO和KEGG通路分析，主要富集在催產(chǎn)素信號(hào)通路(Oxytocin si

5、gnaling pathway)、雌激素信號(hào)通路(Estrogen signaling pathway)、GnRH信號(hào)通路(GnRH signaling pathway)等與初情期密切相關(guān)的信號(hào)通路，從而篩選出8個(gè)候選基因以及6個(gè)發(fā)生絕對(duì)甲基化的基因。(5)siRNA干擾候選基因GRID1在下丘腦原代神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)GnRH mRNA升高（P＜0.05)，GnIHmRNA降低（P＜0.05），KISS1mRNA表達(dá)無顯著變化（P

6、＞0.05）。
　　在山羊初情期啟動(dòng)過程中，(1)下丘腦DNMTs與MBPs mRNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，其中DNMT1、MBD2和MECP2mRNA上調(diào)，DNMT3A和MBD3mRNA下調(diào)。(2)下丘腦全基因組甲基化水平保持不變。(3)下丘腦中DNA甲基化主要發(fā)生在CG位點(diǎn)。(4)不同的基因組功能區(qū)域甲基化水平存在差異，啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平逐漸降低，最低的為5'UTR和外顯子，最高為內(nèi)含子。(5)篩選出了一批可能與初情期相關(guān)的基因如GR