熱休克蛋白90抑制劑Ganetespib預(yù)防肝癌微波消融術(shù)后局部復(fù)發(fā)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　1.通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，探討應(yīng)用第二代熱休克蛋白90(Heat Shock Protein90，HSP90)抑制劑Ganetespib不同濃度作用于肝癌HepG2，對細(xì)胞增殖的影響及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并驗(yàn)證不同溫度對HSP90表達(dá)水平的影響。
　　2.分析微波消融聯(lián)合Ganetespib治療對裸鼠肝癌皮下移植瘤消融后壞死范圍的調(diào)控作用，并比較兩者共同作用后，消融區(qū)周邊HSP90及caspase-3表達(dá)水平的差異，

2、以及對Ganetespib應(yīng)用的生物安全性進(jìn)行評價(jià)。
　　3.分析微波消融聯(lián)合Ganetespib治療對消融治療后裸鼠的腫瘤體積倍增時(shí)間及終點(diǎn)生存時(shí)間的差異。
　　方法：
　　1.用CCK8比色法檢測不同濃度的Ganetespib抑制肝癌HepG2細(xì)胞生長的效果;藥物作用后HepG2細(xì)胞凋亡率的變化應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測;用酶聯(lián)免疫吸附劑實(shí)驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbent

3、assay, ELISA)檢測不同溫度作用后HSP90表達(dá)水平的變化。
　　2.給予裸鼠最高藥物耐受劑量(150mg/kg)，5h后取出動物內(nèi)臟進(jìn)行病理檢查，并同時(shí)送檢無藥物處理的裸鼠動物內(nèi)臟，對比藥物的生物安全性。建立肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型。將40只裸鼠隨機(jī)分配到如下4個(gè)處理組中:(1)單獨(dú)微波消融組;(2)單獨(dú)靜脈注射Ganetespib組;(3)微波消融前2h靜脈注射Ganetespib組;(4)無處理陰性對照

4、組。分別于治療后24h將動物脫頸處死，剝離出腫瘤，經(jīng)2％2，3，5-三苯基氯化四氮唑溶液染色后觀察腫瘤壞死范圍，免疫組化檢查HSP90及caspase-3的表達(dá)。
　　3.建立肝癌HepG2細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型。待腫瘤直徑達(dá)到1.0-1.2cm時(shí)，將20只裸鼠隨機(jī)分配到如下4個(gè)處理組中:(1)單獨(dú)微波消融組;(2)單獨(dú)靜脈注射Ganetespib組;(3)微波消融前2h靜脈注射Ganetespib組;(4)無處理陰性對照組。治療

5、后每隔2-3天觀察腫瘤大小，腫瘤直徑長到2.5cm或生存期達(dá)到40天設(shè)為生存終點(diǎn)，使用Kaplan-Meier生存分析方法比較各處理組達(dá)到研究終點(diǎn)的時(shí)間差異。
　　結(jié)果：
　　1.CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ganetespib呈時(shí)間-劑量依賴性抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖。Annexin-FITC/PI雙染法檢測結(jié)果顯示，Ganetespib藥物作用于細(xì)胞48h后，細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度升高而增大，濃度設(shè)定為30、100、250、50

6、0及1000nmol/l，30nmol/LGanetespib干預(yù)48h后細(xì)胞晚期凋亡率為（16.3±1.22）％(與陰性對照組比較，P＜0.05)，1000nmol/l Ganetespib干預(yù)48h后細(xì)胞晚期凋亡率為(56.6±1.83)％（與其他濃度組比較，P＜0.05）。ELISA法檢測結(jié)果顯示，45℃組的HSP90濃度最高，50℃組次之，60℃組最低。(45℃組與其他各組比較，P＜0.05)
　　2.應(yīng)用Ganetesp

7、ib后沒有影響肝臟、脾臟、腎臟及肺的大體形態(tài)及微觀病理表現(xiàn)。單獨(dú)靜脈注射Ganetespib組給藥后24h沒有觀察到明顯的壞死區(qū)域。單獨(dú)微波消融組凝固壞死范圍7.5±0.3mm。微波消融聯(lián)合靜脈注射Ganetespib組觀察到較大的凝固范圍9.4±0.5mm(P＜0.05，與單獨(dú)微波組比較)。治療后24h，與單獨(dú)微波消融組比較，聯(lián)合應(yīng)用Ganetespib組可以在消融區(qū)周邊觀察到更加微弱的Hsp90表達(dá)帶（表達(dá)帶厚度0.19±0.07m

8、m，染色細(xì)胞21.4±11.2％ vs.0.25±0.13mm，30.3±10.7％，P＜0.05)。消融聯(lián)合Ganetespib組顯示出更多caspase-3的表達(dá)。(表達(dá)帶厚度0.37±0.12mm，染色細(xì)胞數(shù)37.3±15.1％ vs.0.25±0.18mm，27.6±11.9％，P＜0.05)。
　　3.無處理組的平均終點(diǎn)生存時(shí)間(從開始治療的到腫瘤直徑達(dá)25mm)為19.1±2.0天。單獨(dú)應(yīng)用微波消融組的平均終點(diǎn)生存時(shí)間

9、比單獨(dú)靜脈注射Ganetespib組長，前者平均時(shí)間為26.3±2.2天，后者平均時(shí)間為23.2±2.0天(與對照組比較P＜0.05)。微波消融聯(lián)合靜脈注射Ganetespib組表現(xiàn)出明顯延長的生存時(shí)間，平均為33.2±1.9天(與其他組比較P＜0.05)。方差分析結(jié)果顯示，微波消融聯(lián)合藥物治療組腫瘤體積倍增時(shí)間(25.1±1.8天)明顯長于單獨(dú)微波消融組(17.5±1.6天)及單獨(dú)藥物處理組（15.4±2.3天）(P＜0.05)。

10、r>　　結(jié)論：
　　1.第二代HSP90抑制劑Ganetespib能夠抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖，隨著藥物濃度的增加，作用時(shí)間的延長，細(xì)胞活性逐漸下降，并能夠促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡。
　　2.Ganetespib對裸鼠應(yīng)用的生物安全性好。應(yīng)用Ganetespib聯(lián)合熱消融治療，可以抑制熱休克蛋白的表達(dá)，增加微波消融后腫瘤的壞死范圍，促進(jìn)消融區(qū)周邊亞致死溫度帶上腫瘤細(xì)胞的凋亡。
　　3.聯(lián)合應(yīng)用微波消融及Ganet