OD1啟動子上調(diào)多肽篩選體系的建立.pdf

1、超氧化物岐化酶(super oxide dismutase，SOD)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，根據(jù)分布的不同主要分為SOD1(Cu/Zn SOD，主要分布于真核細(xì)胞胞漿)，SOD2(Mn/Fe SOD，主要分布于真核細(xì)胞線粒體和原核細(xì)胞)和SOD3(EC-SOD，主要分布于細(xì)胞外基質(zhì))，不同的SOD均有催化超氧陰離子自由基O2-發(fā)生歧化反應(yīng)的功能，是體內(nèi)重要的氧自由基清除劑。其中，SOD1是發(fā)現(xiàn)最早，研究最廣泛的一類。
　

2、　 氧自由基是直接或間接由分子氧轉(zhuǎn)化而成，外層軌道具有未配對電子的一類化學(xué)分子，包括超氧離子自由基、羥自由基、過氧化氫等。它們具有活潑的化學(xué)活性，極易發(fā)生得到或失去電子的反應(yīng)，從而引發(fā)鏈?zhǔn)阶杂苫磻?yīng)。體內(nèi)的氧自由基包括由于高溫、輻射等原因?qū)е履承┖醴肿庸矁r鍵斷裂而產(chǎn)生的外源性自由基和體內(nèi)各種代謝過程中產(chǎn)生的內(nèi)源性氧自由基。氧自由基是機體代謝正常的中間產(chǎn)物，低濃度的氧自由基是機體執(zhí)行正常生理功能所必需，但在氧自由基異常增多或機體抗氧化

3、能力下降的情況下，氧自由基將通過鏈?zhǔn)阶杂苫磻?yīng)損傷細(xì)胞膜、DNA、蛋白質(zhì)等多種細(xì)胞組分。目前己知氧自由基與衰老、炎癥、缺血再灌注損傷、神經(jīng)退行性病變等多種疾病相關(guān)，清除多余的氧自由基對延長動物壽命，增強其對氧應(yīng)激的承受能力和改善炎癥狀況等多個方面具有顯著的作用。
　　 機體主要通過兩階段的反應(yīng)來清除體內(nèi)的氧自由基：第一階段是超氧陰離子自由基在SOD的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)檠鯕夂瓦^氧化氫；第二階段是過氧化氫在過氧化氫酶(catalase，C

4、AT)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)樗脱鯕?。SOD在氧自由基的清除過程中起著至關(guān)重要的作用。SOD缺陷的大腸桿菌將無法在有氧條件下生存，而適量增加的SOD則能起到減少細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量，減輕脂質(zhì)體過氧化乃至延緩衰老、控制炎癥等多種作用?？梢?，通過控制SOD在體內(nèi)的含量，可以調(diào)節(jié)氧自由基的濃度并從而改變多種相關(guān)的病理、生理狀態(tài)，具有極其重要的臨床意義。
　　 皮膚皺紋的產(chǎn)生機制包括外源性因素和內(nèi)源性因素兩個方面。外源性因素主要有日光照射所致的光

5、老化和其他環(huán)境因素如外傷、感染、空氣污染等對皮膚的損傷；內(nèi)源性因素主要有年齡增長導(dǎo)致的基因調(diào)控變化、內(nèi)源性自由基對細(xì)胞的損傷和機體代謝的紊亂。目前國際上主要針對光老化和內(nèi)源性氧自由基對皮膚的損傷這兩個方面進(jìn)行抗皺研究。光老化指日光長期照射所致的皮膚老化，日光中的紫外線可通過產(chǎn)生高度反應(yīng)的外源性氧自由基損傷皮膚。此外，紫外線最早損傷的部位為調(diào)節(jié)SOD和過氧化氫酶的基因，使二者合成減少，致使氧自由基聚集而損傷細(xì)胞。由上述可見，在皮膚皺紋產(chǎn)生

6、的內(nèi)源性和外源性途徑中，過高濃度的氧自由基都扮演著重要角色。因此，清除體內(nèi)過高的氧自由基對于皮膚抗皺具有重要的意義。如果能適度提高皮膚細(xì)胞內(nèi)SOD含量，則可以通過減少氧自由基的含量來減少對皮膚的損傷，從而保護(hù)皮膚，減少皺紋。
　　 雖然針對SOD的研究已有多年，但目前還沒有能夠?qū)嶋H進(jìn)入臨床應(yīng)用的SOD類藥物，這是因為SOD作為一種蛋白質(zhì)藥物，具有制備價格昂貴，不能直接進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用、半衰期短、易誘發(fā)免疫反應(yīng)等缺陷，且具體使用劑

7、量也不易控制。目前針對SOD藥用方面的研究主要包括研究藥物載體、發(fā)現(xiàn)SOD的小分子替代物和尋找能上調(diào)內(nèi)源性SOD表達(dá)藥物等途徑，據(jù)此，我們設(shè)計了一個利用報告基因技術(shù)篩選具有上調(diào)內(nèi)源性SOD1表達(dá)的隨機多肽篩選系統(tǒng)，試圖同時克服上述多種問題。
　　 報告基因是指其表達(dá)產(chǎn)物易被檢測且易與內(nèi)源性背景蛋白相區(qū)別的基因。通過將特定基因的轉(zhuǎn)錄控制元件克隆到報告基因載體，可以通過報告基因的表達(dá)來直觀地檢測目標(biāo)基因的表達(dá)情況。紅色熒光蛋白(re

8、d fluorenscent protein，RFP)是一種分子量為28 kD的熒光蛋白，可自動發(fā)射熒光、無需任何輔助因子和底物的參與，且無需裂解細(xì)胞即可檢測活體組織和細(xì)胞的基因表達(dá)，作為報告基因具有其特有的優(yōu)越性。
　　 本研究利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了含人SOD1啟動子區(qū)的紅色熒光蛋白報告基因質(zhì)粒，并通過轉(zhuǎn)染和抗生素篩選技術(shù)得到了能穩(wěn)定表達(dá)該質(zhì)粒的細(xì)胞系。此細(xì)胞系在適宜濃度的SODl誘導(dǎo)劑卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbol m

9、yristateacetate，PMA)刺激下，紅色熒光蛋白表達(dá)明顯增加，紅色熒光強度在一定范圍內(nèi)呈線性增長。這為篩選具有內(nèi)源性SOD1表達(dá)上調(diào)功能的藥物提供了一個方便、靈敏的工具。
　　 為了克服蛋白質(zhì)大分子常具有的免疫原性，我們使用連續(xù)的十二個隨機氨基酸組成的多肽作為篩選的對象。由于細(xì)胞膜具有選擇性通透性，大部分蛋白質(zhì)分子無法直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)。我們選用Ⅰ型人類免疫缺陷病毒(human immunodeficie

10、ncy virus I，HIV-I)Tat蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(proteintransduction domain，PTD)作為攜帶多肽入胞的載體。HIV-Tat是一種以非傳統(tǒng)內(nèi)吞途徑、非能量依賴，非受體介導(dǎo)方式直接穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的多肽，它能攜帶多種不同大小和性質(zhì)的生物活性物質(zhì)如核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)等進(jìn)入細(xì)胞，是一種理想的多肽轉(zhuǎn)運載體。此外，融合蛋白中的增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent prot

11、ein，EGFP)可作為蛋白入胞的指示劑，提示隨機多肽在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。針對肽庫的容量性和多樣性問題，我們利用點突變技術(shù)引入36個隨機堿基，形成隨機表達(dá)文庫，其理論容量達(dá)到2012，從而保證了隨機多肽庫的容量性和多樣性。
　　 為了能夠進(jìn)行高通量的多肽篩選，我們總結(jié)出一套切實可行的蛋白純化及藥物篩選流程。利用融合蛋白上的His標(biāo)簽純化融合蛋白，將純化后的融合蛋白與穩(wěn)定表達(dá)報告基因質(zhì)粒的細(xì)胞孵育一定時間后，融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞，通過