以HIV-1啟動子為靶點(diǎn)的藥物篩選系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用.pdf

1、背景和目的:
　　AIDS是由于HIV感染后引起的一種免疫缺陷性疾病。HIV-1既可以利用宿主的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，也能編碼產(chǎn)生一些調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行自我的調(diào)控。在HIV-1基因組LTR區(qū)存在著和各種轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，各種調(diào)節(jié)蛋白通過和DNA相互作用以及蛋白間的相互作用形成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)。針對HIV-1 LTR區(qū)以及宿主細(xì)胞中HIV-1表達(dá)調(diào)節(jié)蛋白的研究，為研制抗AIDS藥物提供了新的方式。<

2、br>　　中藥在抗HIV/AIDS上具有特有的優(yōu)勢，但由于缺乏科學(xué)有效的篩選手段，使得抗HIV/AIDS中藥在應(yīng)用和療效上嚴(yán)重落后于西藥。如何從豐富的中藥資源寶庫中篩選出有效的抗HIV/AIDS藥物，是急需解決的問題。本研究擬建立一種新的方法，利用報(bào)告基因技術(shù)篩選作用于HIV-1啟動子靶點(diǎn)的能夠潛在抗HIV/AIDS的藥物，并通過假病毒方法來驗(yàn)證所建立的藥物篩選系統(tǒng)。
　　方法:
　　將設(shè)計(jì)合成的HIV-1核心啟動子雙鏈序列

3、克隆進(jìn)pGL4.17螢光素酶報(bào)告載體中，通過雙酶切以及DNA測序驗(yàn)證后得到pGL4.17-HIV1P陽性重組載體;采用脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染將pGL4.17-HIV1P轉(zhuǎn)入HT-H9細(xì)胞中，通過G418篩選出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行分組;將4種中藥（杜仲、黃芩、苦參、雙黃連）給大鼠灌胃后采血，分離含藥血清，同時(shí)用0.9％氯化鈉灌胃的老鼠血清作為對照，將不同含藥血清分別作用于各組細(xì)胞后，通過檢測螢光素酶活性來反映HIV-1啟動子表達(dá)水平，

4、構(gòu)建以HIV-1啟動子為靶點(diǎn)的藥物篩選系統(tǒng)。將假病毒載體pNL4-3.1uc.RˉEˉ轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用不同含藥學(xué)清作用各組細(xì)胞后，通過ELISA法檢測p24蛋白表達(dá)量，驗(yàn)證所建立的篩選系統(tǒng)的可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0分析。
　　結(jié)果:
　　1將設(shè)計(jì)合成的HIV-1核心啟動子序列克隆到pGL4.17載體后，經(jīng)雙酶切和測序鑒定顯示和設(shè)計(jì)序列完全一致，得到陽性重組載體pGL4.17-HIV1P。
　　2

5、將載體pGL4.17-HIV1P轉(zhuǎn)染HT-H9細(xì)胞后，用G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。
　　3螢光素酶檢測結(jié)果顯示:苦參組細(xì)胞螢光值為1110780.5±15076.6，杜仲組為864557.5±15441.9，黃芩組為1054500.5±26279.0，與對照組螢光值291089.6±10457.7相比，螢光值顯著升高（P＜0.01）;雙黃連組螢光值為225858.4±14257.7，與對照組相比顯著降低(P＜0.01)。<

6、br>　　4用ELISA法檢測p24蛋白含量，結(jié)果顯示:苦參組細(xì)胞的OD值為2.267±0.159，杜仲組為1.851±0.076，黃芩組為2.044±0.122，與對照組1.403±0.024相比OD值顯著升高(P＜0.01);雙黃連組OD值為1.042±0.023，與對照組相比顯著降低(P＜0.01)。p24蛋白含量檢測結(jié)果和螢光素酶檢測結(jié)果正相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1成功構(gòu)建含有HIV-1核心啟動子序列的螢光素酶報(bào)告基