面向靛玉紅生物制備的細(xì)胞色素P450 BM-3半理性定向進(jìn)化.pdf

1、采用蛋白質(zhì)工程手段對(duì)酶進(jìn)行改造、使其具備特定的性質(zhì)，常常是利用酶進(jìn)行生物催化與生物轉(zhuǎn)化的前提。為了獲得催化吲哚羥基化時(shí)以靛玉紅為主要產(chǎn)物的生物催化劑、滿足靛玉紅生物制備的需要，本論文采用半理性定向進(jìn)化手段對(duì)細(xì)胞色素P450BM-3進(jìn)行了改造，改變了該酶催化吲哚羥基化時(shí)以靛藍(lán)為主產(chǎn)物的性質(zhì)，得到了一個(gè)以靛玉紅為反應(yīng)主產(chǎn)物的突變酶，為利用P450BM-3進(jìn)行靛玉紅的生物制備創(chuàng)造了條件。論文同時(shí)對(duì)所得突變酶的催化性質(zhì)、該突變酶催化吲哚羥基化的

2、反應(yīng)過(guò)程和靛玉紅生成機(jī)理進(jìn)行了研究，分析了突變酶以靛玉紅為反應(yīng)主產(chǎn)物的分子機(jī)制，討論了與此相關(guān)的P450BM-3的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。
　　 首先，采用半理性定向進(jìn)化思想，基于對(duì)已有P450BM-3定向進(jìn)化研究結(jié)果的分析，選擇以P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/E435T)為親本、以D168位點(diǎn)為靶點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)飽和突變，構(gòu)建了飽和突變文庫(kù)。在96孔板中進(jìn)行了突變文庫(kù)的篩選，包括培養(yǎng)工程菌、誘導(dǎo)突變酶的表達(dá)、進(jìn)行吲哚的

3、羥基化反應(yīng)和萃取產(chǎn)物等過(guò)程。然后根據(jù)所得產(chǎn)物的顏色和組成，從突變文庫(kù)中獲得了一個(gè)催化產(chǎn)物為紅色、催化產(chǎn)物組成以靛玉紅為主的突變酶D168W。經(jīng)高效液相色譜分析，該突變酶的吲哚羥基化產(chǎn)物中，靛玉紅的含量是靛藍(lán)含量的9倍。
　　 其后，對(duì)該突變酶D168W的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了考察，測(cè)定了酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，考察了其催化活力與pH值和溫度的關(guān)系，確定了最適反應(yīng)條件。研究發(fā)現(xiàn)，D168W突變雖然使靛玉紅成為了吲哚羥基化反應(yīng)的主產(chǎn)物，但該突變不僅

4、降低了酶對(duì)于吲哚的親和力（Km比親本增大3.7倍），同時(shí)也降低了電子耦合效率。
　　 之后，對(duì)突變酶D168W催化吲哚羥基化的反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，研究該酶催化合成靛玉紅的可能反應(yīng)途徑和機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該酶在催化吲哚羥基化時(shí)，主要的直接羥基化產(chǎn)物是通過(guò)C-2位羥基化產(chǎn)生的2-羥吲哚。雖然靛紅在吲哚羥基化的早期就已產(chǎn)生這一現(xiàn)象說(shuō)明突變酶能同時(shí)催化C-3位的羥基化，但可以推斷，D168W催化吲哚羥基化時(shí)偏向于發(fā)生C-2的羥基化。靛玉紅

5、有可能來(lái)自靛紅與3-羥吲哚的反應(yīng)，也有可能來(lái)自2-羥吲哚與3-羥吲哚的反應(yīng)。D168W突變酶對(duì)吲哚的轉(zhuǎn)化率較低，只有不到25％的吲哚被轉(zhuǎn)化為各種羥基化產(chǎn)物。這與在酶學(xué)性質(zhì)考察中發(fā)現(xiàn)D168W突變降低了酶對(duì)吲哚的親和力的現(xiàn)象是一致的。
　　 最后，采用分子模擬和分子對(duì)接計(jì)算程序，對(duì)D168W突變酶催化吲哚反應(yīng)的羥基化區(qū)域選擇性進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D168W突變改變了酶催化吲哚的區(qū)域選擇性，使吲哚的C-2比C-3更接近于酶的活性中

6、心，從而從分子水平上解釋了靛玉紅成為主產(chǎn)物的原因。此外，還對(duì)D168W突變改變酶區(qū)域選擇性的機(jī)理進(jìn)行了分析，提出了一個(gè)可能的原因，即D168W突變改變了一個(gè)與底物通道有關(guān)的α-螺旋在空間的取向，從而間接影響了底物通道的構(gòu)成、并最終改變了吲哚與P450BM-3結(jié)合時(shí)的空間取向，導(dǎo)致羥基化位點(diǎn)選擇性發(fā)生改變。
　　 課題研究以靛玉紅的生物制備為目標(biāo)對(duì)P450BM-3這一極具應(yīng)用潛力的羥基化酶進(jìn)行了半理性定向進(jìn)化。由于根據(jù)對(duì)已有P45