人細胞色素P450 2D6單克隆抗體的制備.pdf

1、目的：細胞色素P450(cytochrome p-450，CYP)2D6是CYP酶系中1個重要的亞型，其參與多種藥物的代謝。制備抗人CYP2D6的單克隆抗體，為研究CYP2D6在藥物代謝中的作用提供新的工具與思路。 方法：以正常成人肝臟總蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠后，取小鼠的脾細胞與同系小鼠來源的骨髓瘤細胞融合，融合細胞在含有次黃嘌呤(hypoxanthine)、氨基喋呤(aminopterin)、胸腺嘧啶(thymine)

2、和10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內培養(yǎng)，得到雜交瘤細胞。建立ELISA法以及CYP2D6特異性底物右美沙芬體外代謝實驗法對雜交瘤細胞進行篩選。篩選出培養(yǎng)液對右美沙芬的代謝有抑制作用的陽性細胞株，有限稀釋法對細胞稀釋、培養(yǎng)后，再篩選。得到分泌特異性CYP2D6抗體的雜交瘤細胞，獲得CYP2D6的單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)。測定其對右美沙芬代謝的抑制率，并比較單克隆抗體與化學抑制劑奎尼丁對右美沙芬代謝抑制率

3、的影響。 結果： (1)用正常人肝臟總蛋白免疫的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合得到了雜交瘤細胞。 (2)應用ELISA方法，篩選468孔培養(yǎng)的雜交瘤細胞，共得到分泌IgG抗體的陽性孔135個，陽性率為28.85％。最后選擇68孔繼續(xù)篩選。 (3)經右美沙芬體外代謝抑制試驗，在68孔細胞中篩選出了1個孔的陽性雜交瘤細胞株。經三次有限稀釋法培養(yǎng)和右美沙芬體外代謝抑制試驗再篩選，對陽性雜交瘤細胞株進行純化，確認其是

4、單克隆細胞。這個單克隆細胞產生的抗體可以有效抑制CYP2D6對其特異性底物右美沙芬的代謝作用，抑制率達到90.21％。 (4)比較獲得的mAb抗與奎尼丁對右美沙芬代謝的影響，在加入的細胞培養(yǎng)液量為10、20、30、40、50 μ 1時，mAb對右美沙芬的代謝抑制率分別為：90.15％、89.83％、89.86％、89.70％和89.89％；在加入的奎尼丁的終濃度分別為0.5、1、2、4、8 μ g/ml時，奎尼丁對右美沙芬的代謝