重組P450 BM3工程菌制備靛藍(lán)過(guò)程優(yōu)化、P450 BM3-GDH共表達(dá)體系建立及其在靛藍(lán)制備中的應(yīng)用研究.pdf

1、靛藍(lán)是一種重要的色素,它廣泛應(yīng)用于印染、醫(yī)藥和食品工業(yè).近年來(lái),利用生物法制備靛藍(lán)已經(jīng)引起了相關(guān)研究者的重視,這對(duì)解決化學(xué)合成靛藍(lán)所帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題具有重大意義.本文利用能表達(dá)P450 BM3的重組大腸桿菌催化吲哚制備靛藍(lán),研究了游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞催化的反應(yīng)特性.構(gòu)建了能共表達(dá)P450 BM3和葡萄糖脫氫酶的重組菌,解決了P450 BM3催化反應(yīng)的輔酶再生問(wèn)題.以該重組菌作為還原型輔酶NADPH的再生系統(tǒng),研究了其催化吲哚制備靛藍(lán)的

2、反應(yīng)特性. 第一,針對(duì)P450 BM3在重組菌中的表達(dá)量很低,不能很好地滿足反應(yīng)的需要,采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和雜合設(shè)計(jì)相結(jié)合對(duì)重組E coliBL21(pET28a(+)-P450 BM3)表達(dá)P450 BM3的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化.先用Placket-Burman設(shè)計(jì),從眾多影響重組菌表達(dá)P450 BM3的因素中有效地篩選出了最為重要的因素,再用響應(yīng)面法進(jìn)行了優(yōu)化,得到了較佳表達(dá)條件.通過(guò)優(yōu)化,P450 BM3

3、酶活從37.6×10<'-30>U/ml提高到了57.9×10<-30>U/ml.優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合較好. 第二,采用重組E coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3)細(xì)胞制備靛藍(lán),考察了實(shí)驗(yàn)中各反應(yīng)條件對(duì)重組菌細(xì)胞進(jìn)行催化反應(yīng)的影響.結(jié)果表明,pH 7.0-7.5,溫度35℃,底物濃度0.5 mmol/L 為較好的反應(yīng)條件.在此條件下,反應(yīng)進(jìn)行8h后,靛藍(lán)收率可以達(dá)到29.43﹪;加入5g/L葡萄糖時(shí),

4、可以將靛藍(lán)收率提高到44.08‰高濃度的底物和產(chǎn)物對(duì)合成反應(yīng)具有一定的抑制作用.在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考察了輔酶再生對(duì)重組E coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3)細(xì)胞催化吲哚制備靛藍(lán)的反應(yīng)的影響,結(jié)果表明,在反應(yīng)體系中加入NADP<'+>和葡萄糖脫氫酶,能有效地促進(jìn)NADPH再生,使反應(yīng)得以持續(xù)進(jìn)行. 第三,采用了海藻酸鈣膠囊化重組E coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3)細(xì)胞催化吲哚制備靛

5、藍(lán).考察了固定化條件對(duì)反應(yīng)的影響,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),海藻酸鈉濃度為1.0﹪(w/v), CaCl2濃度為2﹪(w/V),凝膠反應(yīng)時(shí)間為6 min時(shí),可以得到較高的靛藍(lán)收率.考察了固定化細(xì)胞催化的反應(yīng)特性,發(fā)現(xiàn)固定化重組菌細(xì)胞催化吲哚制備靛藍(lán)的最適反應(yīng)溫度和最適pH分別為35℃和pH 7.5;當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.5mmol/L時(shí)靛藍(lán)收率最高.但同樣存在與E coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3)游離細(xì)胞相類似的問(wèn)題,即在過(guò)高濃度底

6、物存在時(shí)對(duì)細(xì)胞催化的抑制作用.固定化大大提高了重組菌的熱穩(wěn)定性,固定化細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行5批次催化反應(yīng)后,靛藍(lán)收率并沒(méi)有明顯變化. 第四,為了解決輔酶再生問(wèn)題,構(gòu)建了能共表達(dá)P450 BM3和葡萄糖脫氫酶的重組 E.coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310).對(duì)該重組菌表達(dá)P450 BM3和葡萄糖脫氫酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化,P450 BM3和葡萄糖脫氫酶的比酶活分別可達(dá)8173.13U/mg protei

7、n和0.045 U/mg protein. 第五,在優(yōu)化的基礎(chǔ)上對(duì)重組 E.coil BL21(pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310)催化輔酶再生的能力進(jìn)行了考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重組菌在催化吲哚制備靛藍(lán)的反應(yīng)過(guò)程中,在不添加額外的輔酶和葡萄糖脫氫酶的情況下,細(xì)胞能夠完成吲哚到靛藍(lán)的高效催化.同時(shí)還研究了重組 E.coli BL21(pET28a(+)-P450 BM3-gdh0310)催化吲哚制備靛藍(lán)的反應(yīng)特性.結(jié)果

8、表明,吲哚濃度為5 mmol/L,葡萄糖濃度為100mmol/L,重組菌于35℃、100 r/min的條件下具有最高的催化效率.通過(guò)分批加入底物的方式,能有效解除底物的抑制作用.五次加入吲哚共13 mmol/L,反應(yīng)進(jìn)行到24 h,收率仍可達(dá)80﹪以上,反應(yīng)液中最終靛藍(lán)濃度可達(dá)4.71 mmol/L,(1235.2 mg/L). 第六,分別對(duì)有輔酶參與的P450 BM3和葡萄糖脫氫酶催化雙底物的酶促動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了初步研究.采用有