淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450基因的克隆與初步功能鑒定.pdf

1、淡色庫(kù)蚊是多種病毒病和寄生蟲(chóng)病的主要傳播媒介，是室內(nèi)叮吸騷擾人類的主要害蟲(chóng)，采用化學(xué)殺蟲(chóng)劑防治此類害蟲(chóng)具有相當(dāng)長(zhǎng)的歷史，其優(yōu)點(diǎn)是操作方便，迅速有效，因此在媒介昆蟲(chóng)防治中占有主導(dǎo)地位，曾為媒介昆蟲(chóng)和蟲(chóng)媒傳染病的控制做出過(guò)巨大貢獻(xiàn)。但由于蚊蟲(chóng)對(duì)環(huán)境高度的適應(yīng)能力，頻繁使用化學(xué)殺蟲(chóng)劑后，很容易產(chǎn)生抗藥性，并且抗性程度增長(zhǎng)快，抗性分布范圍廣，目前蚊蟲(chóng)對(duì)施用過(guò)的殺蟲(chóng)劑幾乎都產(chǎn)生了不同程度的抗性，大大影響了它的殺蟲(chóng)效果。因此，及時(shí)掌握蚊蟲(chóng)抗藥性的現(xiàn)

2、狀，研究其發(fā)生發(fā)展規(guī)律及治理對(duì)策是科學(xué)合理地進(jìn)行化學(xué)防治的關(guān)鍵。因此，研究媒介抗藥性產(chǎn)生的機(jī)制并進(jìn)行適宜治理實(shí)乃當(dāng)務(wù)之急。本研究擬從克隆抗藥性相關(guān)基因入手，并對(duì)其進(jìn)行功能鑒定，為探討最終治理媒介抗藥性奠定基礎(chǔ)。本文從以下三個(gè)方面進(jìn)行了研究。 研究一溴氰菊酯選育淡色庫(kù)蚊抗藥性的研究在實(shí)驗(yàn)室條件下選育擬除蟲(chóng)菊酯抗性品系，了解抗性產(chǎn)生、發(fā)展的規(guī)律，為抗性機(jī)理研究提供模型，為防制工作提供理論依據(jù)。采用浸液法，用溴氰菊酯LC50劑量對(duì)淡色

3、庫(kù)蚊Ⅳ齡幼蟲(chóng)用藥篩選。 結(jié)果表明，敏感品系淡色庫(kù)蚊經(jīng)溴氰菊酯處理11代，LC50由0.09ppb上升至55.21ppb，抗性高達(dá)613倍，抗性水平呈近指數(shù)曲線上升；證明淡色庫(kù)蚊對(duì)溴氰菊酯能在短時(shí)期內(nèi)產(chǎn)生抗性并且迅速發(fā)展；選育的淡色庫(kù)蚊抗溴氰菊酯品系與敏感品系的毒力回歸線平行，表明抗性品系選育成功。 研究二淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450CYP6F1基因的分子克隆及不同期的表達(dá)鑒定為克隆淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450（CYP6F1）基因

4、并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)差異的鑒定，本研究采用RT-PCR技術(shù)和RACE策略，從淡色庫(kù)蚊（Culexpipienspallens）對(duì)溴氰菊酯抗性品系4齡幼蟲(chóng)中克隆細(xì)胞色素P450基因（CYP6F1），用相應(yīng)的軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并用定量PCR和半定量RT-PCR分析敏感、抗性品系蚊的CYP6F1表達(dá)水平及對(duì)蚊各期CYP6F1進(jìn)行表達(dá)差異鑒定。 結(jié)果表明，成功克隆出CYP6F1基因。CYP6F1基因全長(zhǎng)1639bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?527

5、bp，編碼508個(gè)氨基酸。序列分析顯示，該基因與已報(bào)告的日本的致倦庫(kù)蚊（Culexquinquefasciatus）細(xì)胞色素P450基因（GenBank/NCBIAB001324）有99％同源性，并具有所有細(xì)胞色素P450基因的保守性特征，一個(gè)膜錨定信號(hào)、兩個(gè)還原酶結(jié)合位點(diǎn)、一個(gè)典型的血紅素蛋白結(jié)合位點(diǎn)和ETLR基序等。定量PCR結(jié)果表明，CYP6F1在淡色庫(kù)蚊對(duì)溴氰菊酯抗性品系中表達(dá)水平高于敏感品系，提示CYP6F1基因可能與殺蟲(chóng)劑抗

6、藥性相關(guān)。CYP6F1mRNA在淡色庫(kù)蚊各個(gè)發(fā)育階段也有不同的表達(dá)，以4齡幼蟲(chóng)表達(dá)水平最高。 研究三淡色庫(kù)蚊細(xì)胞色素P450CYP6F1基因的初步功能研究為鑒定細(xì)胞色素P450CYP6F1基因與淡色庫(kù)蚊溴氰菊酯抗性的關(guān)系，本研究擴(kuò)增CYP6F1基因編碼區(qū)，構(gòu)建蚊細(xì)胞表達(dá)載體pIB/V5-His/CYP6F1，轉(zhuǎn)染蚊C6/36細(xì)胞。稻瘟菌素穩(wěn)定篩選和單克隆化后，細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用RT-PCR和Westernblot鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因

7、細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。不同濃度的溴氰菊酯處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及對(duì)照未轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和轉(zhuǎn)無(wú)關(guān)基因細(xì)胞后，用MTT法、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定、流式細(xì)胞儀及顯微鏡下觀察細(xì)胞存活率、細(xì)胞增殖速度、細(xì)胞周期及細(xì)胞生長(zhǎng)情況等。 結(jié)果顯示，成功構(gòu)建昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)載體并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，RT-PCR和Westernblot檢測(cè)重組表達(dá)載體（pIB/V5-His/CYP6F1）在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的蚊細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。不同濃度的溴氰菊酯處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染CYP6F1基因細(xì)胞存