阿倫膦酸鈉對大鼠股骨骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程的影響.pdf

1、第一部分大鼠骨質(zhì)疏松性動物模型建立
　　目的:觀察切除卵巢對雌性SD大鼠股骨骨密度和生物力學(xué)特性的影響，為后續(xù)實驗提供有效的骨質(zhì)疏松模型。
　　方法:選用100只4月齡成年雌性Sprague—Dawley(SD)大鼠，體重250-300克，隨機分為空白組5只，剩余95只大鼠在無菌條件下切除雙側(cè)卵巢進行去勢，建立骨質(zhì)疏松動物模型。術(shù)后8周，應(yīng)用小動物Micro-CT對近端股骨進行掃描與三維重建分析;用雙能X線檢測去勢組大鼠與空

2、白組大鼠骨密度并做統(tǒng)計學(xué)分析;采用生物力學(xué)實驗，比較去勢組大鼠和空白組大鼠骨的力學(xué)強度。
　　結(jié)果:Micro-CT檢測結(jié)果表明，去勢組大鼠骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)如骨小梁厚度、骨皮質(zhì)厚度和骨小梁數(shù)量明顯低于空白組。雙能X線檢測顯示8周以后，去勢組大鼠與空白組大鼠骨密度分別為0.219±0.039(g/cm2)和0.249±0.063(g/cm2)，骨密度與空白組大鼠有明顯差別（P＜0.05）。生物力學(xué)研究測試顯示與空白對照組相比，去勢8周以

3、后其力學(xué)強度出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:通過對雌性大鼠采取切除卵巢去勢的方式，能夠在8周后建立鼠的骨質(zhì)疏松模型。這是一種指導(dǎo)骨質(zhì)疏松發(fā)病機理的探究和新藥的研發(fā)理想實用的骨質(zhì)疏松動物模型。
　　第二部分阿倫膦酸鈉在大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中的實驗研究
　　目的:本研究是以去卵巢Sprague-Dawley(SD)大鼠建立的骨質(zhì)疏松骨折模型為研究對象，通過檢測骨生物力學(xué)性能的變化情況和利用

4、組織形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)等實驗方法，探討阿倫膦酸鈉對大鼠股骨骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程的相關(guān)因子在不同時期生物學(xué)特征的影響，以闡明其作用機制，為臨床應(yīng)用阿倫膦酸鈉防治骨質(zhì)疏松性骨折提供理論依據(jù)和有益線索。
　　方法:造模成功后將模型組內(nèi)的60只大鼠右側(cè)股骨制作成中段開放性骨折并予克氏針內(nèi)固定。剩余的30只僅穿克氏針，不造成骨折作為假手術(shù)組。骨折模型組隨機分成對照組和治療組，每組30只;阿倫膦酸鈉組:骨折固定術(shù)后二膦酸鹽藥物

5、按1.15mg/(kg.week)灌胃，每周一次;假手術(shù)和對照組:骨折固定術(shù)后給予同樣劑量及次數(shù)的生理鹽水灌胃。分別于術(shù)后1，2，4，6，8和12W各組隨機選取5只大鼠摘眼球取血，離心取血清，測定ALP、BMP-2、bFGF、IGF-1的表達變化。行雙能X線檢查比較各組骨折愈合情況。處死大鼠后，在骨折端取骨痂標本，4％多聚甲醛固定過夜。各組經(jīng)5％硝酸脫鈣組織石蠟切片行HE和抗酒石酸(TRAP)染色、BMP-2、bFGF、IGF-1免疫組

6、化檢測，并對第4和12周的股骨標本進行Micro-CT，掃描電鏡觀察和三點彎曲生物力學(xué)檢測各組骨折愈合情況。
　　結(jié)果:骨痂的雙能X線檢測和組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比經(jīng)阿倫膦酸鈉治療兩周后骨折愈合進程明顯加快。第2周組織切片HE染色發(fā)現(xiàn)，阿倫膦酸鈉組骨痂形成增多，軟骨內(nèi)成骨過程較對照組加快。連續(xù)治療6周后，對照組骨折線清晰可見，阿倫膦酸鈉組骨折線模糊，提示更早達到骨性愈合。藥物干預(yù)治療后，與對照組相比阿倫膦酸鈉組TRAP染色破骨

7、細胞數(shù)量明顯減少且成逐漸減少趨勢。ELISA結(jié)果顯示，假手術(shù)組血清中ALP、BMP-2、bFGF、IGF-1在所有時間段內(nèi)無顯著性差異。阿倫膦酸鈉組血清ALP和對照組相比在第2、4和6周的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。治療兩周后，阿倫膦酸鈉組和對照組中BMP-2、bFGF、IGF-1的表達均達到高峰，8～12周時回落到正常水平。治療前8周，對照組血清中BMP-2少于阿倫膦酸鈉組，兩組在第2和6周的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。治療后第4和8周，對照組中bFGF

8、少于阿倫膦酸鈉組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比，治療后第2和4周阿倫膦酸鈉組血清中IGF-1升高明顯，兩組見差異有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化結(jié)果顯示阿倫膦酸鈉組和對照組在骨折愈合中BMP-2、bFGF、IGF-1的表達細胞定位無差別。治療4周后BMP-2免疫組化平均光密度值阿倫膦酸鈉組高于對照組，8周時低于對照組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。治療4，8周后bFGF免疫組化平均光密度值阿倫膦酸鈉組高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。治療2和4周后IGF-1免

9、疫組化平均光密度值阿倫膦酸鈉組高于對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Micro CT成像顯示對照組的骨痂體積和礦化比例在治療后4周明顯少于阿倫膦酸鈉組，而治療12周后沒有明顯改變。SEM結(jié)果顯示，治療12周后阿倫膦酸鈉組骨痂組織吸收陷窩數(shù)明顯低于對照組。生物力學(xué)試驗檢測兩個時間點阿倫膦酸鈉組標本最大載荷均高于對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:阿倫膦酸鈉具有上調(diào)大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中ALP、BMP-2、bFGF、IGF-1等促進成骨的