TCF1介導(dǎo)的Wnt-β-catenin信號通路促進小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化.pdf

1、目的：Wnt/β-catenin信號通路是一種經(jīng)典的Wnt信號通路，參與廣泛的生物學(xué)過程，諸如細胞分化、增殖、生存、凋亡、黏附、肥大、老化。有研究表明，在分化早期階段激活Wnt/β-catenin信號通路可促進小鼠胚胎干細胞向中胚層及心肌細胞分化，然而，Wnt/β-catenin信號通路促心肌細胞分化作用的具體機制仍不清楚?；罨腤nt/β-catenin信號通路中β-catenin蛋白的降解減少，大量β-catenin在細胞內(nèi)聚集，穩(wěn)

2、定的β-catenin進入細胞核，與Tcf/Lef1轉(zhuǎn)錄子結(jié)合并激活下游靶基因的表達進而調(diào)控細胞生理特性，其中Tcf/Lef1家族中包括Tcf1、Tcf3、Tcf4和Lef1。因此，本研究主要探討Wnt/β-catenin信號通路中Tcf/Lef1轉(zhuǎn)錄子在小鼠胚胎干細胞（mESCs）向心肌細胞分化中的作用。
　　方法：首先采用懸浮一步培養(yǎng)法形成擬胚體（EBs）,在EBs形成后第2天至第5天加入CHIR99021，命名為CHIR99

3、021組；在EBs形成后第2天至第5天加入Wnt3a，命名為Wnt3a組，將自動分化的EBs命名為對照組。采用qRT-PCR法檢測中胚層標(biāo)志基因Brachyury、心肌前體細胞標(biāo)志基因Nkx2.5、心肌細胞特異性標(biāo)志基因α-MHC、cTnT和Cx43 mRNA的表達。運用免疫熒光染色法檢測心肌細胞特異性蛋白--肌球蛋白重鏈（α-MHC）、肌鈣蛋白T（cTNT）及膜聯(lián)蛋白43（CX43）的定位表達。采用 Western blot法檢測α-

4、MHC蛋白相對表達量。從而對比分析CHIR99021與Wnt3a在心肌細胞分化中的作用。然后使用PiggyBac vector（PB載體）構(gòu)建PB-Tcf/Lef1載體以過表達Tcf/Lef1基因，將puromycin加入培養(yǎng)液中以篩選過表達細胞系；采用pLKO.1慢病毒載體構(gòu)建Tcf/Lef1-shRNA載體，使用293T細胞進行病毒包被，將獲取的病毒感染小鼠胚胎干細胞，再用puromycin篩選低表達細胞系。將獲得的過表達/低表達細

5、胞系通過懸浮一步培養(yǎng)法形成EBs，在EBs形成后的第7天將其貼壁培養(yǎng)，通過倒置顯微鏡觀察其生長狀態(tài)，采用 qRT-PCR法檢測Brachyury、Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43 mRNA的表達。運用免疫熒光染色法檢測心肌細胞特異性蛋白--肌球蛋白重鏈（α-MHC）的定位表達。采用Western blot法檢測α-MHC蛋白相對表達量。從而對比分析Tcf/Lef1轉(zhuǎn)錄子在小鼠胚胎干細胞向心肌細胞分化中作用。
　　結(jié)果：

6、通過免疫熒光染色法我們發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞源擬胚體中有心肌細胞特異性蛋白的定位表達，在CHIR99021和Wnt3a誘導(dǎo)分化過程中，通過qRT-PCR法我們發(fā)現(xiàn)Brachyury在分化第7天達高峰，而后逐漸下降；Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43的基因表達量逐漸增加，第15天增加最顯著，且CHIR99021組和Wnt3a組高于對照組；CHIR99021組優(yōu)于Wnt3a組（*P<0.05，**P<0.01）。通過Western blo

7、t法我們發(fā)現(xiàn) CHIR99021組和 Wnt3a組α-MHC蛋白表達量明顯高于對照組，CHIR99021組高于Wnt3a組。我們使用PB載體過表達Tcf/Lef1基因，采用pLKO.1慢病毒載體低表達Tcf/Lef1基因，通過qRT-PCR和Western blot發(fā)現(xiàn)陽性細胞構(gòu)建成功。隨后我們發(fā)現(xiàn)過表達Tcf/Lef1細胞系在分化過程中Brachyury表達量在第7天達高峰，而后逐漸下降；Nkx2.5、α-MHC、cTnT和Cx43的

8、基因表達量逐漸增加，第15天增加最為明顯，且均高于對照組，其中 Tcf1最為顯著（*P<0.05，**P<0.01）。通過Western blot法我們發(fā)現(xiàn)過表達Tcf/Lef1細胞系在分化過程中心肌細胞標(biāo)志蛋白α-MHC相對表達量均高于對照組，且 Tcf1最為明顯。相反，低表達Tcf/Lef1抑制了心肌細胞的分化，尤其是Tcf1的抑制作用較為明顯。
　　結(jié)論：Wnt/β-catenin信號通路中Tcf1轉(zhuǎn)錄子可促進小鼠胚胎干細胞