β-arrestin2在肝纖維化中的作用及CP-25對其的影響.pdf

1、肝纖維化是由各種致病因子引起的以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積、結(jié)締組織異常增生為特點(diǎn)的肝臟結(jié)構(gòu)和功能的異常病理變化。肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是ECM的主要來源，是肝纖維化形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。β-arrestin2是arrestin家族成員之一，它是眾所周知的 G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）調(diào)節(jié)蛋白，參與受

2、體的脫敏和內(nèi)化。近年來研究發(fā)現(xiàn)，它還可以調(diào)節(jié)許多非 GPCRs受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，比如可與TGF-βIII型受體（type III TGF-βreceptor，TβRIII）相互作用參與胞內(nèi)信號通路，影響細(xì)胞功能。課題組前期研究表明，體外使用β-arrestin2 siRNA轉(zhuǎn)染HSC可抑制其增殖和膠原產(chǎn)生，但尚缺乏整體水平的研究。白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是從芍藥干燥根中提取的活性部位，其主要

3、成分（>40%）是芍藥苷，為提高芍藥苷的生物利用度，經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造合成了芍藥苷-6’-O-苯磺酸酯（paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate，CP-25）。課題組以往研究表明，TGP和芍藥苷均具有減輕肝纖維化的作用，那么CP-25是否也能發(fā)揮抗肝纖維化作用？其是否通過調(diào)節(jié)β-arrestin2發(fā)揮作用呢？為此，本研究首先收集臨床肝纖維化患者組織標(biāo)本，檢測不同程度肝纖維化患者肝臟中β-arrestin2和TβR

4、III的表達(dá)情況；使用β-arrestin2-/-小鼠建立四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化模型，觀察整體水平β-arrestin2基因敲除是否可緩解肝纖維化；同時(shí)，對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠灌胃給予CP-25，觀察CP-25是否具有抗肝纖維化作用；進(jìn)一步體外研究選用人肝星狀細(xì)胞株LX-2，轉(zhuǎn)染β-arrestin2過表達(dá)質(zhì)粒，探討CP-25可能的作用機(jī)制。
　　目的：收集臨床肝纖維化患

5、者肝臟標(biāo)本，檢測β-arrestin2和TβRIII的表達(dá)；分別用野生型（wide type，WT）C57BL/6J小鼠和β-arrestin2-/-小鼠誘導(dǎo)肝纖維化，觀察肝纖維化形成情況；對CCl4誘導(dǎo)的野生型肝纖維化小鼠灌胃給予CP-25，觀察CP-25能否能減輕肝纖維化；體外使用β-arrestin2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，再給予CP-25，闡明其作用機(jī)制。
　　方法：選取不同程度肝纖維化患者肝組織石蠟切片，通過免疫組化

6、法檢測β-arrestin2和TβRIII在肝臟中的表達(dá)和分布；用CCl4將野生型C57BL/6J小鼠和β-arrestin2-/-小鼠誘導(dǎo)為肝纖維化，試劑盒檢測血清轉(zhuǎn)氨酶水平、肝勻漿氧化及抗氧化指標(biāo)、羥脯氨酸含量，CCK-8法檢測T、B淋巴細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞亞群的比例，Western blot法檢測肝組織中β-arrestin2、Collagen I、TGF-β1、TβRIII的表達(dá)變化以及 Smad2、Smad3、A

7、kt信號通路的激活情況；CCl4腹腔注射C57BL/6J小鼠建立肝纖維化模型，分為正常對照組、模型組、CP-25（25、50、100 mg/kg）組、TGP組（100 mg/kg）、秋水仙堿組（0.15 mg/kg），檢測纖維化相關(guān)指標(biāo)的變化；體外使用β-arrestin2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞，給予CP-25，觀察LX-2細(xì)胞β-arrestin2、Collagen I、TβRIII的表達(dá)變化以及 Smad2、Smad3、Akt信

8、號通路的激活情況。
　　結(jié)果：
　　1.β-arrestin2、TβRIII在不同程度肝纖維化患者肝臟中的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)染色法檢測肝內(nèi)膽管結(jié)石和不同程度肝纖維化患者肝臟組織標(biāo)本，結(jié)果顯示，β-arrestin2在肝纖維化患者肝臟中的表達(dá)明顯高于肝內(nèi)膽管結(jié)石患者，隨著肝纖維化程度的加重，β-arrestin2表達(dá)增加；而TβRIII在肝纖維化患者肝臟中的表達(dá)減少。
　　2.β-arrestin2基因敲除對小

9、鼠肝纖維化的影響
　　用CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，相比于野生型小鼠，β-arrestin2-/-小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平降低；肝勻漿超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）活力增加，丙二醛（malonaldehyde，MDA）、羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量減少；CCK-8檢測顯示T、B淋巴細(xì)胞的增殖被抑制；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示脾臟CD4

10、+CD62L+T細(xì)胞比例上升，CD4+CD69+T細(xì)胞比例下降，Th17/Treg比率下降；Western blot結(jié)果顯示，相比于野生型小鼠，β-arrestin2-/-小鼠肝組織中β-arrestin2幾乎不表達(dá)，Collagen I、TGF-β1表達(dá)下降，TβRIII的表達(dá)增加，p-Smad2、p-Smad3、p-Akt的表達(dá)均下降，而Smad2、Smad3、Akt的表達(dá)無明顯變化。
　　3. CP-25對CCl4誘導(dǎo)的肝纖

11、維化小鼠纖維化的影響
　　與肝纖維化模型組相比，灌胃給予CP-25后，小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平降低；肝臟中SOD、GSH活力增加，MDA、Hyp含量減少；CCK-8檢測顯示T、B淋巴細(xì)胞的增殖被抑制；脾臟CD4+CD62L+T細(xì)胞比例上升，CD4+CD69+T細(xì)胞比例下降，Th17/Treg比率下降；Western blot結(jié)果顯示，CP-25可降低肝組織Collagen I和β-arrestin2的表達(dá)。
　　4. CP-25對

12、β-arrestin2過表達(dá)的LX-2細(xì)胞中Collagen I、β-arrestin2和TβRIII表達(dá)的影響
　　Western blot結(jié)果顯示，TGF-β1刺激使LX-2細(xì)胞I型膠原表達(dá)增加，CP-2510-8~10-5 mol/L可抑制 LX-2細(xì)胞中 I型膠原的生成；向 LX-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-C2-arrestin2質(zhì)粒，β-arrestin2、Collagen I的表達(dá)均增加，而TβRIII的表達(dá)降低，給予C

13、P-25可降低β-arrestin2、Collagen I的表達(dá)，增加TβRIII的表達(dá)。5. CP-25對β-arrestin2過表達(dá)的LX-2細(xì)胞中Smad2、Smad3和 Akt信號通路激活的影響
　　Western blot結(jié)果顯示，LX-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染高表達(dá)?-arrestin2質(zhì)粒后，p-Smad2、p-Smad3和p-Akt的表達(dá)均增加，而Smad2、 Smad3和 Akt的表達(dá)無明顯變化；CP-25可抑制Smad2、

14、 Smad3和 Akt信號的激活。
　　結(jié)論：
　　1.在不同程度肝纖維化患者的肝臟標(biāo)本中，隨著纖維化程度的加重，β-arrestin2表達(dá)增加，提示β-arrestin2可能與纖維化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　2.相比于野生型肝纖維化小鼠，β-arrestin2-/-小鼠肝纖維化程度明顯減輕，脾臟CD4+CD62L+T細(xì)胞比例上升，CD4+CD69+T細(xì)胞比例下降，Th17/Treg比率下降；肝臟TβRIII表達(dá)增加，p-

15、Smad2、p-Smad3、p-Akt的表達(dá)降低，提示β-arrestin2基因敲除可能通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群比例、抑制Smad2、 Smad3和 Akt信號通路的激活，減輕小鼠肝纖維化。
　　3. CP-25灌胃給予肝纖維化小鼠可降低轉(zhuǎn)氨酶水平，減少肝臟中羥脯氨酸含量和Collagen I、β-arrestin2水平，升高CD4+CD62L+T細(xì)胞比例，降低CD4+CD69+T細(xì)胞比例和Th17/Treg比率，提示CP-25可發(fā)揮抗