去神經(jīng)后疼痛大鼠術后早期鎮(zhèn)痛的脊髓背角結構可塑性體視學研究.pdf

1、神經(jīng)病理性疼痛(Neuropathic pain)是指：周圍和(或)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、原發(fā)和(或)繼發(fā)性損害、功能障礙或短暫性紊亂引起的疼痛?？杀憩F(xiàn)為感覺遲鈍(dysesthesia)、感覺異常(paraesthesia)、痛覺過敏(hyperalgesia)和痛覺超敏(allodynia)。去神經(jīng)后疼痛綜合征(如：幻肢痛)是神經(jīng)病理性疼痛的一種常見類型，見于截肢或去神經(jīng)支配患者，嚴重影響患者的生活質量。由于其基本病理生理機制不明，缺乏特異

2、性治療措施，鎮(zhèn)痛治療患者滿意度不高，是困擾醫(yī)學界的一大難題。目前認為，幻肢痛的發(fā)生與中樞一系列不恰當?shù)目伤苄苑磻粗袠忻艋P系密切。中樞敏化是指外周神經(jīng)損傷后，中樞感覺神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和感覺神經(jīng)回路興奮性的持續(xù)性增強，感受閾值降低，感受野擴大。
　　 中樞敏化以突觸傳遞的長時程增強(long term potentiation，LTP)為特征，LTP的形成伴隨有脊髓背角內突觸前囊泡蛋白合成的增多及低閾值的Aβ纖維從脊髓背角的第

3、Ⅲ層長芽至第Ⅱ層。上述突觸可塑性的變化可能導致脊髓背角內突觸數(shù)量的增加。但目前并無對脊髓背角內突觸具體數(shù)量進行定量的研究報道。
　　 小膠質細胞和星形膠質細胞在中樞敏化中的重要作用日益受到重視。目前認為：神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和維持過程存在膠質細胞與神經(jīng)元之間的“對話”。膠質細胞可通過直接調節(jié)突觸的數(shù)量和突觸間隙的神經(jīng)遞質水平，或通過其分泌的炎性介質和神經(jīng)營養(yǎng)因子間接的作用于感覺神經(jīng)元，導致感覺神經(jīng)元興奮性改變。研究已經(jīng)證實外周神

4、經(jīng)損傷只會激活脊髓背角內的小膠質細胞。由于星形膠質細胞的活化依賴于小膠質細胞的活化，因此，外周神經(jīng)損傷后膠質細胞的活化主要存在于脊髓背角內。
　　 受損神經(jīng)的炎癥反應是脊髓背角內小膠質細胞和星形膠質細胞活化的主要誘發(fā)因素，可引起膠質細胞胞體肥大和數(shù)量增多。然而，外周神經(jīng)完全橫斷后炎癥反應很輕，其脊髓背角內膠質細胞的活性和數(shù)量變化可能不同于其他類型的神經(jīng)損傷，其中樞敏化的表現(xiàn)形式可能也不同。遺憾的是，目前尚無研究對此作出報道。

5、r>　　 如上所述，外周神經(jīng)損傷后，突觸、小膠質細胞和星形膠質細胞在中樞敏化的形成中有著重要的作用，其數(shù)量的改變勢必影響神經(jīng)損傷后慢性疼痛的發(fā)生及程度。目前尚缺乏對其數(shù)量進行準確定量的研究。此外，截肢(外周神經(jīng)橫斷)所致的神經(jīng)損傷方式有別于其他類型的損傷，其中樞可塑性改變可能也與其他類型的神經(jīng)損傷不同，從而導致其治療方式的不同。本研究采用新的體視學方法和新的體視學技術--光學體視框結合特異性染色方法來對單側坐骨神經(jīng)橫斷后脊髓背角內神經(jīng)

6、元、突觸、小膠質細胞和星形膠質細胞的數(shù)量進行定量研究，以期為幻肢痛相關的中樞可塑性表現(xiàn)提供新的解剖學資料和基礎指標。
　　 積極的治療截肢后的急性疼痛，可預防或減輕幻肢痛。文獻報道：常用于術后鎮(zhèn)痛治療的特異性環(huán)氧化酶(Cyclooxygenase，COX)-2抑制劑--帕瑞昔布具有抑制中樞敏化的作用，因此本研究同時觀察了帕瑞昔布對坐骨神經(jīng)橫斷后疼痛相關行為學表現(xiàn)和上述各種粒子數(shù)量的影響。
　　 體視學形態(tài)定量研究的主要研

7、究對象是組織病理切片，組織在包埋和染色過程中的脫水處理會造成組織明顯皺縮。因此，在進行形態(tài)定量研究時必須考慮皺縮對結果的影響。本研究將首先采用設計依賴體視學(design-based stereology)結合Cavalieri’s原理，估計包埋和染色后組織體積的皺縮系數(shù)及長度的壓縮系數(shù)，對后續(xù)的形態(tài)定量結果進行校正，以獲得更準確的形態(tài)學定量資料。
　　 第一部分
　　 目的：以設計依賴體視學結合Cavalieri’s原

8、理，研究石蠟包埋和切片染色對大鼠脊髓腰膨大體積及長度的影響。對后續(xù)的形態(tài)定量結果進行校正，以獲得更準確的形態(tài)學定量資料。
　　 方法：4％多聚甲醛經(jīng)心臟灌流固定后取大鼠脊髓腰膨大(L4-6)，稱重、測量長度并以比重法測定其密度。重量除以密度即可得到固定后體積。將腰膨大均分為6段，隨機抽取其中一段用石蠟包埋。垂直于脊髓長軸方向切取厚度(H)為14μm的連續(xù)切片。按等距隨機原則每15張抽取一張切片，第一張切片在第1～15張中隨機抽取

9、。選中的切片HE染色，Visiopharm體視學設備測定脊髓橫截面面積(a)和染色后灰質的厚度和白質的厚度，并計算切片的平均厚度(h)。A乘以H(14μm)即可得到包埋后脊髓腰膨大的體積；A乘以h即可得到染色后脊髓腰膨大的體積。用包埋后和切片染色后腰膨大的體積除以其包埋前的體積，即為石蠟包埋和切片染色后組織的皺縮系數(shù)。用染色后長度除以固定后長度即可得到染色后的壓縮系數(shù)。
　　 結果：大鼠脊髓腰膨大固定后體積為96.80±13.8

10、5mm2，長度為1.53±0.25cm。石蠟包埋后體積為60.19±19.15 mm2，顯著低于固定后體積(P<0.05)。染色后體積為42.97±16.02mm2，灰質長度為0.85±0.17cm，白質長度為1.00±0.18cm，顯著低于固定后體積和長度(P<0.05)。石蠟包埋后和切片染色后脊髓的皺縮系數(shù)分別為62.9％±20.5％和44.8％±16.6％，長度的壓縮系數(shù)灰質為56.9％±17.1％，白質為66.7%±19.5％。

11、
　　 結論：石蠟包埋和染色處理將造成大鼠脊髓腰膨大的體積明顯皺縮和長度明顯壓縮，形態(tài)定量研究必須考慮到組織皺縮和壓縮對結果的影響。
　　 第二部分
　　 目的：采用設計依賴體視學結合光學體視框，探討大鼠單側坐骨神經(jīng)橫斷所致的去神經(jīng)后疼痛綜合征是否存在脊髓背角內神經(jīng)元、突觸、小膠質細胞和星形膠質細胞數(shù)量的可塑性變化。
　　 方法：健康成年SD大鼠11只隨機分為2組：(1)假手術組及(2)單側坐骨神經(jīng)橫斷組

12、。術后隔天觀察動物的行為學改變(自噬)并評分。術后28d處死動物，取其腰膨大(L4-6)進行石蠟包埋及切片，并分別行尼氏染色(以顯示和計數(shù)神經(jīng)元)、突觸素(synaptophysin)免疫組化染色(以顯示和計數(shù)突觸數(shù)量)、離子鈣接頭蛋白-1(ionized calciumbindingadaptor molecular-1，iba-1)免疫組化染色(以顯示和計數(shù)小膠質細胞)和膠質纖維酸性蛋白(glia fibrillary acidic

13、 protein，GFAP)免疫組化染色(以顯示和計數(shù)星形膠質細胞)。以光學體視框(一種新的體視學技術)估計脊髓背角內神經(jīng)元、突觸、小膠質細胞和星形膠質細胞的數(shù)量。
　　 結果：
　　 (1)單側坐骨神經(jīng)橫斷后，大部分動物出現(xiàn)自噬，評分9-11分。
　　 (2)單側坐骨神經(jīng)橫斷會導致手術側脊髓背角內突觸數(shù)量顯著增加(P<0.05)及小膠質細胞和星形膠質細胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)。與非手術側相比，手術側L4-

14、6脊髓中間段組織單位長度(1mm)的脊髓背角內突觸數(shù)量增加了74.3％；小膠質細胞數(shù)量減少了44.9％，星形膠質細胞數(shù)量減少了35.8％。L4-6脊髓的吻側和尾側節(jié)段無上述變化。
　　 結論：去神經(jīng)后疼痛大鼠脊髓背角內會發(fā)生結構上的可塑性改變，表現(xiàn)為突觸數(shù)量顯著增加，及小膠質細胞、星形膠質細胞數(shù)量的減少。上述結構可塑性可能是導致去神經(jīng)后疼痛綜合征形成中樞敏化的結構基礎。
　　 第三部分
　　 目的：研究單側坐骨神

15、經(jīng)橫斷術后早期運用特異性COX-2抑制劑帕瑞昔布鎮(zhèn)痛治療對去神經(jīng)后疼痛大鼠脊髓背角內突觸、小膠質細胞及星形膠質細胞數(shù)量的影響。
　　 方法：健康成年SD大鼠13只隨機分為2組，分別行(1)單側坐骨神經(jīng)橫斷術，及(2)單側坐骨神經(jīng)橫斷術后3d連續(xù)給予帕瑞昔布腹腔注射。術后隔天觀察動物的行為學改變(自噬)并評分。動物處死、組織切片的抽取及脊髓背角內突觸、小膠質細胞、星形膠質細胞計數(shù)同第二部分。
　　 結果：
　　 (

16、1)帕瑞昔布術后早期鎮(zhèn)痛在一定程度上可緩解大鼠自噬程度；
　　 (2)術后早期使用帕瑞昔布對去神經(jīng)后疼痛大鼠脊髓背角內突觸數(shù)量的可塑性無顯著影響(P>0.05)，但可一定程度的抑制脊髓背角內膠質細胞數(shù)量減少的程度(手術側脊髓背角內小膠質細胞和星形膠質細胞數(shù)量較非手術側分別減少了29.9％和20.2％)(P<0.05)。
　　 結論：術后早期使用帕瑞昔布可在一定程度上緩解去神經(jīng)后疼痛，其作用可能與其抑制小膠質細胞和星形膠質