可溶性HVEM融合蛋白和CIITA突變體聯(lián)合抑制T細(xì)胞功能的體外和體內(nèi)研究.pdf

1、T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在器官移植排斥中占有關(guān)鍵地位。許多證據(jù)表明T細(xì)胞在移植排斥發(fā)生、發(fā)展階段都具有十分重要的作用。T細(xì)胞的活化需要“雙信號(hào)”系統(tǒng):T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)/主要組織相容性復(fù)合體(major histoeompatibilitycomplex,MHC)提供活化的第一信號(hào)；APC和T細(xì)胞表面的共信號(hào)分子提供第二信號(hào),缺乏第二信號(hào),將導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)反應(yīng),誘導(dǎo)免疫耐受。共信號(hào)分子表達(dá)于T細(xì)胞表面,其

2、與配體結(jié)合不僅能增強(qiáng)T細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞(APC)的連接及促進(jìn)TCR與MHC抗原肽復(fù)合物的結(jié)合,還可向T細(xì)胞傳遞其完全活化所必須的輔助信號(hào)。T細(xì)胞不同的共信號(hào)通路組成了相互影響、相互依存的多層次級(jí)聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為調(diào)控T細(xì)胞活化及其介導(dǎo)的免疫應(yīng)答提供了有效的靶點(diǎn),將T細(xì)胞作為靶細(xì)胞通過(guò)各種途徑阻斷其活化是免疫治療的可行方案。 B和T細(xì)胞衰減分子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)是共信號(hào)分子免疫球

3、蛋白超家族的最新成員,與CTLA-4有一定的同源性,為抑制型受體。皰疹病毒進(jìn)入調(diào)節(jié)子(herpesvirus entry mediator,HVEM)是BTLA唯一的配體,屬于TNFR家族的成員。研究發(fā)現(xiàn)HVEM-BTLA可介導(dǎo)抑制信號(hào)的傳遞,抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的表達(dá),且這一抑制功能的發(fā)揮具有TCR復(fù)合物依賴性。 主要組織相容性復(fù)合體(MHC)II類(lèi)分子可將外源性抗原遞呈給T輔助細(xì)胞,引起抗原特異性T細(xì)胞的活化,MHC

4、II類(lèi)分子表達(dá)的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平,其中反式作用因子(MHC II transactivator,CIITA)是MHC II類(lèi)基因表達(dá)的“分子開(kāi)關(guān)”,決定著MHC-II類(lèi)分子的存在與否及表達(dá)程度,也決定了免疫應(yīng)答的本質(zhì)。因此CIITA是對(duì)MHC-II類(lèi)分子遞呈抗原過(guò)程進(jìn)行干預(yù)的理想靶點(diǎn),可以在自身免疫損傷和移植排異過(guò)程中進(jìn)行免疫抑制干預(yù)。 基于上述兩個(gè)方面,本研究構(gòu)建了HVEM融合蛋白真核表達(dá)體系,并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定,

5、然后以自行制備的HVEM-Ig融合蛋白為工具激活BTLA-HVEM通路、抑制TCR/CD3復(fù)合物介導(dǎo)的T細(xì)胞激活；同時(shí)聯(lián)合給予攜帶了CIITA突變體的重組腺病毒,通過(guò)CIITA突變體競(jìng)爭(zhēng)性抑制野生型CIITA的生物學(xué)活性,促使MHC II類(lèi)分子表達(dá)降低,在體內(nèi)體外觀察其對(duì)T細(xì)胞的作用,為后續(xù)探討其應(yīng)用于移植排斥反應(yīng)的可行性提供實(shí)驗(yàn)支持。 第一部分 HVEM-Ig融合蛋白真核表達(dá)體系的建立及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定為了對(duì)HVEM-BTLA這

6、一共信號(hào)通路進(jìn)行深入研究,我們構(gòu)建了鼠HVEM胞外區(qū)和鼠IgG2a Fc段重組真核表達(dá)質(zhì)粒,并在CHO細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了HVEM-Ig融合蛋白的穩(wěn)定分泌性表達(dá)。首先RT-PCR從BALB/c小鼠脾細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增HVEM胞外區(qū)片段,WT-1雜交瘤細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增鼠IgG2a Fc片段,連入真核分泌型表達(dá)載體pSecTagA,獲得重組質(zhì)粒pSecTagA-HVEMIg。將重組質(zhì)粒pSecTagA-HVEMIg用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,Hycr

7、omycin B加壓篩選,建立穩(wěn)定表達(dá)HVEM-Ig的CHO細(xì)胞庫(kù)。用Mouse IgG ELISA試劑盒檢測(cè)各細(xì)胞克隆的表達(dá)量,篩選表達(dá)量大于1pg/cell·24h的細(xì)胞克隆進(jìn)行保留；再進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn),最終保留5個(gè)連續(xù)三次檢測(cè)結(jié)果均大于1pg/cell·24h的克隆,用于大規(guī)模轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)增。高表達(dá)細(xì)胞克隆進(jìn)行大規(guī)模轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng),細(xì)胞擴(kuò)增期用含10％FCS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng),并保持Hygromycin B篩選壓力,待細(xì)胞長(zhǎng)滿轉(zhuǎn)瓶后,換無(wú)

8、血清培養(yǎng)液培養(yǎng)5-7天,收集上清液。利用Protein A與目的蛋白IgG2aFc段特異性結(jié)合的性質(zhì),采用rProtein A-Sepharose FF親和層析,快速獲取目的蛋白。 將獲得的目的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)實(shí)驗(yàn),證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物為HVEM-Ig融合蛋白：SDS-PAGE在還原狀態(tài)下檢測(cè)到約45 kD的特異蛋白,而在非還原狀態(tài)下可檢測(cè)到約90 kD和120kD的兩種特異蛋白,說(shuō)明表達(dá)產(chǎn)物為二聚體或三聚體形式,符合HVEM-Ig融合

9、蛋白的表達(dá)形式。Western Blot分析該樣品可被抗鼠HVEM抗體特異性識(shí)別,證明該蛋白為HVEM-Ig融合蛋白。 第二部分：攜帶CIITA突變體的腺病毒的制備、擴(kuò)增及純化以及體外活性檢測(cè)CIITA突變體基因的獲得是以小鼠Ⅳ型CIITA基因的cDNA片段為模板通過(guò)PCR-SOE的方法構(gòu)建N端缺失第325-678位堿基的突變體。然后通過(guò)同源重組的方法獲得攜帶CIITA突變體的腺病毒骨架pAd-CIITA,轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞

10、擴(kuò)增后獲得完整的重組腺病毒顆粒Ad-CIITA。用CsCl密度梯度超速離心的方法對(duì)重組腺病毒進(jìn)行純化,并用TCID50法計(jì)算病毒滴度。然后將純化的重組腺病毒Ad-CIITA感染HeLa細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)觀察介導(dǎo)表達(dá)的CIITA突變體抑制誘導(dǎo)型MHC-Ⅱ類(lèi)分子表達(dá)的作用。結(jié)果顯示用重組腺病毒Ad-CIITA感染HeLa細(xì)胞株,使IFN-γ誘導(dǎo)表達(dá)MHC-Ⅱ類(lèi)分子的細(xì)胞陽(yáng)性率比對(duì)照組下降40～45％,平均減少42.5％；平均熒光強(qiáng)度降低62

11、～67％,平均下降64.5％。說(shuō)明重組腺病毒Ad-CIITA介導(dǎo)的CIITA突變體基因轉(zhuǎn)移可以抑制細(xì)胞表面誘導(dǎo)型MHC-Ⅱ類(lèi)分子表達(dá)。 第三部分 HVEM-Ig融合蛋白的體外功能研究及其聯(lián)合CIITA突變體的體內(nèi)研究絲裂霉素處理的C57BL/6鼠脾細(xì)胞,與BALB/c鼠T細(xì)胞混合,加入不同濃度HVEM-Ig或?qū)φ誌gG,進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR),結(jié)果：[3H]-TdR摻入法顯示HVEM-Ig呈劑量依賴性的抑制同種T細(xì)胞增殖

12、(HVEM-Ig終濃度為150μg/ml時(shí)抑制率約50％)(P＜0.05),而IgG對(duì)同種T細(xì)胞的增殖沒(méi)有影響。HVEM-Ig組培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-10的水平均低于于未處理和對(duì)照IgG組(P＜0.05),IL-4的水平各組沒(méi)有明顯差異。用CD3抗體和亞劑量CD25刺激BALB/c鼠T細(xì)胞,加入HVEM-Ig或?qū)φ誌gG,3H-TdR摻入法觀察T細(xì)胞增殖情況,結(jié)果同MLR結(jié)果類(lèi)似,上清中各細(xì)胞因子分泌水平同前

13、述實(shí)驗(yàn)符合。收集同樣處理的T細(xì)胞經(jīng)穿膜后用流式抗體進(jìn)行標(biāo)記,觀察胞內(nèi)細(xì)胞因子分泌情況,HVEM-Ig處理組同對(duì)照組相比胞內(nèi)IL-10表達(dá)降低。 利用新型熒光染料CFSE體內(nèi)研究HVEM-Ig聯(lián)合CIITA突變體對(duì)同種異體T細(xì)胞免疫功能的抑制作用。CFSE具有與活體細(xì)胞結(jié)合并隨細(xì)胞分裂熒光強(qiáng)度系列減半的特性,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)細(xì)胞8至10個(gè)分裂周期的可視化,成為研究體內(nèi)環(huán)境下淋巴細(xì)胞增殖情況的新技術(shù)。取BALB/C鼠T細(xì)胞體

14、外用CFSE染色后尾靜脈輸入經(jīng)9 Gy Co60輻照后的C57BL/鼠體內(nèi),在第0,2天注射HVEM-Ig融合蛋白和重組腺病毒Ad-CIITA,對(duì)照組注射IgG和空載病毒Ad-GFP。3天后殺C57BL/6鼠取脾和淋巴結(jié)細(xì)胞流式觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)同對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組CD4+T、CD8+T細(xì)胞增殖明顯減低。這些結(jié)果提示聯(lián)合應(yīng)用。HVEM-Ig和CIITA突變體可以抑制同種異體T細(xì)胞的活化和增殖。 結(jié)論：本課題成功構(gòu)建了HVEM-Ig融合

15、蛋白真核表達(dá)體系,表達(dá)及純化HVEM-Ig融合蛋白,并對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了研究工具。在此基礎(chǔ)上將已構(gòu)建好的攜帶CIITA突變體基因的重組腺病毒骨架轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞擴(kuò)增,獲得完整的重組腺病毒顆粒Ad-CIITA,并體外驗(yàn)證了其活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在體外單獨(dú)應(yīng)用HVEM-Ig融合蛋白可以抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌,CIITA突變體重組腺病毒可以抑制MHC II類(lèi)分子的表達(dá)。最后體內(nèi)聯(lián)合應(yīng)用純化的HVEM-Ig融合