綠色熒光蛋白體外轉染體內示蹤異體骨髓基質干細胞的研究.pdf

1、目的：觀察經(jīng)質粒為載體，脂質體介導的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉染的骨髓間充質干細胞體外表達及體內示蹤情況，觀察兩組骨髓間充質干細胞肌肉內植入的存活和炎性反應等情況，為骨髓間充質干細胞的異體移植提供實驗依據(jù)。 方法：以質粒病毒為載體，PT67細胞為包裝細胞，介導綠色熒光蛋白轉染新西蘭大白兔的骨髓基質干細胞，在相差顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察，流式細胞儀檢測GFP的表達效率，G418培養(yǎng)

2、液篩選轉染細胞，常規(guī)培養(yǎng)。在體外培養(yǎng)的第二代骨髓基質干細胞中加入含BMP-2的誘導培養(yǎng)基分別在培養(yǎng)2周后，與未轉染的同期成骨細胞對照，在相差顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察，流式細胞儀檢測GFP的表達效率，對比轉染組與對照組細胞細胞含量及生長曲線情況，并將轉染后的細胞分別植人新西蘭大白兔和日本大耳白兔背部肌肉內，在第3d、1w、3w、5w作活檢，利用激光共聚焦顯微鏡、透射電鏡及光學顯微鏡觀察異體BMSCs存活情況及周圍炎性細胞浸潤等組織學變化。

3、 結果：1、骨髓基質干細胞體外培養(yǎng)后貼壁、集落生長，細胞呈梭形、多角形，有多個大小不一的突起，胞漿淡藍色，含有較大的顆粒，核卵圓形，細胞分裂相多見，連續(xù)傳代培養(yǎng)生長良好。細胞生長曲線示細胞生長狀態(tài)良好。培養(yǎng)2周后骨髓基質干細胞表面CD44抗原表達陽性。2、BM-SCs經(jīng)質粒病毒感染后，植入宿主后24時，冰凍切片后熒光顯微鏡下即可檢測到有綠色熒光表達，72h表達最強，隨著時間推移綠色熒光蛋白陽性細胞均逐漸減少，到5周時仍可見少量表

4、達。3、術后自體組、異體組移植組動物切口均未出現(xiàn)明顯的紅腫及分泌物，無異常死亡。初期HE染色可見自體、異體組細胞炎性反應均明顯，有較多炎性細胞浸潤，以白細胞為主，隨時間推移植入?yún)^(qū)炎性反應不明顯。 結論：1、異體骨髓基質干細胞容易獲取、來源充足、可以大量擴增，加入誘導液后細胞形態(tài)發(fā)生改變并向成骨細胞分化，可作為骨組織工程的種子細胞。2、GFP基因的導人不會影響骨髓間充質干細胞的活性和生物學特性，可應用于活體細胞的實時檢測。3、BM