人支氣管上皮細胞共培養(yǎng)對肺成纖維細胞的作用及調(diào)控機制.pdf

1、目的：支氣管哮喘常伴有氣道的結(jié)構(gòu)重塑，其典型特征之一是氣道上皮下成纖維細胞活動增強所產(chǎn)生的基膜增厚、氣道順應(yīng)性降低，導(dǎo)致持久性氣道阻力增高，發(fā)生難以逆轉(zhuǎn)的通氣功能損壞。氣道重塑的機制目前仍不清楚，因此在臨床上難以獲得有效的防治方法。探討氣道重塑的細胞與分子機制有重要意義。 本研究假設(shè)，支氣管上皮細胞與成纖維細胞的相互作用平衡有利于維持氣道微環(huán)境結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)態(tài)。在損傷、應(yīng)激等條件下，細胞間相互作用平衡可能發(fā)生偏離，從而啟動重塑機制

2、。為論證這一假設(shè)，本研究擬建立人支氣管上皮細胞(HBECs)與人肺成纖維細胞(HLF)共培養(yǎng)體系，觀察在蛙皮素受體亞型-3(BRS-3)激活、臭氧(O<,3>)應(yīng)激等不同條件下支氣管上皮細胞對肺成纖維細胞增殖和膠原合成的調(diào)控，并初步探討作用介質(zhì)，從氣道上皮功能穩(wěn)態(tài)新角度認(rèn)識氣道重塑機制。 方法： 1．體外培養(yǎng)人支氣管上皮細胞株，人胚肺成纖維細胞株，并建立人支氣管上皮細胞與人胚肺成纖維細胞共培養(yǎng)體系。 2．BRS-

3、3激活、O<,3>應(yīng)激支氣管上皮細胞后與肺成纖維細胞共培養(yǎng)，用MTT比色法檢測肺成纖維細胞及支氣管上皮細胞的增殖活性，羥脯氨酸試劑盒檢測成纖維細胞膠原合成的狀況。 3．為初步探討支氣管上皮細胞共培養(yǎng)對成纖維細胞的作用介質(zhì)，收集支氣管上皮細胞培養(yǎng)上清液，EIdSA 法及放射免疫分析法檢測TGF-β<,1>、FNF-α、PGE<,2>含量，并觀察其時間變化以及其含量與成纖維細胞活動的關(guān)系。 4．為證實共培養(yǎng)效應(yīng)的重要介質(zhì)為T

4、GF-β<,1>，TGF-β<,1>反義寡核甘酸(ASO)設(shè)計，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，MTT法檢測TGF—β<,1> ASO轉(zhuǎn)染的支氣管上皮細胞對成纖維細胞的增殖活性。 5．為觀察支氣管上皮細胞TGF-β<,l>表達是否受與成纖維細胞共培養(yǎng)的影響，用免疫組織化學(xué)法檢測單獨培養(yǎng)的HBECs與共培養(yǎng)的HBECs TGF-β<,1>表達差異，并進行定量分析。 結(jié)果： 1．在正常共培養(yǎng)條件下支氣管上皮細胞與成纖維細胞的增殖活

5、 性相互受到抑制，BRS-3激活、O<,3>應(yīng)激條件下支氣管上皮細胞對肺成纖維細胞增殖與膠原合成的作用由抑制轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M。 2．在BRS-3激活、O<,3>應(yīng)激條件下支氣管上皮細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β<,l>含量高于對照組，并與成纖維細胞的增殖與膠原合成呈顯著正相關(guān)。TNF-α分泌量極少，且與成纖維細胞的增殖與膠原合成相關(guān)性不大。PGE2隨時間延長分泌量減少，并與成纖維細胞的增殖與膠原合成呈顯著負(fù)相關(guān)。兩種處理組TGF-β<,

6、l>、TNF-a、PGE<,2>分泌隨時間延長趨勢各有其特點。 3．TGF—p<,l>ASO轉(zhuǎn)染HBEC<,s>并激活BRS-3后，其對共培養(yǎng)的成纖維細胞的促增殖活性明顯減弱(P<0.01)。 4．相同預(yù)處理條件下，HBECs單獨培養(yǎng)或共培養(yǎng)時 TGF-β<,l>表達差異無顯著性(P>0.05)，說明成纖維細胞對支氣管上皮細胞的TGFβ<,l>表達無明顯反作用。HBECs單獨培養(yǎng)時O<,3>應(yīng)激明顯促進TGF-β<,l>

7、表達(P<0.05)；而在共培養(yǎng)條件下用P3513激活BRS-3、O<,3>應(yīng)激均可使TGF-β<,l>表達增多(P<0.05)。 結(jié)論： 1．在正常條件下支氣管上皮細胞與肺成纖維細胞的增殖活性相互抑制，O<,3>應(yīng)激及BRS-3激活可使上皮細胞對成纖維細胞增殖及膠原合成的抑制作用轉(zhuǎn)化為促進作用。 2．O<,3>應(yīng)激及BRS-3激活的支氣管上皮細胞TGF-β<,l>分泌增多、PGE<,2>合成減少，是引起成纖維細