塵螨、過(guò)氧化氫對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的影響及機(jī)制研究.pdf

1、支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種嚴(yán)重影響人類健康的慢性呼吸道疾病。研究顯示,全球哮喘病人約3億,我國(guó)約有3000萬(wàn)哮喘患者,而且有不斷增加的趨勢(shì)。哮喘是基因與環(huán)境因素共同導(dǎo)致的復(fù)雜疾病,盡管經(jīng)由GINA推薦的規(guī)范化治療方案可以讓大部分患者得到有效控制,但依然不能改變哮喘的自然病史。同時(shí)全球哮喘的規(guī)范化治療及哮喘控制率距GINA的目標(biāo)還相差甚遠(yuǎn)。我國(guó)的哮喘診治率非常不樂(lè)觀,加上現(xiàn)有的哮喘治療藥物價(jià)格偏高,很多患者無(wú)法承受巨大的醫(yī)療支出,這也使

2、得哮喘的規(guī)范化治療陷入了困境,同時(shí)目前對(duì)哮喘確切的致病機(jī)制仍然不清楚,因此探討哮喘發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)仍然是呼吸專業(yè)關(guān)注的重要課題。
　　 氣道上皮細(xì)胞(AEC),作為氣道抵抗外來(lái)刺激的第一道防線,在固有免疫中發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)也證實(shí),AEC是哮喘固有免疫與獲得性免疫聯(lián)系的橋梁,在多種哮喘觸發(fā)因素作用下,AEC釋放多種炎性介質(zhì),與免疫、炎性細(xì)胞及氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞發(fā)生廣泛的聯(lián)系,參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展?，F(xiàn)在認(rèn)為:AEC在哮喘

3、氣道炎癥的啟動(dòng)和維持中扮演關(guān)鍵角色。
　　 哮喘中存在著免疫失衡,多種細(xì)胞因子參與了其發(fā)生、發(fā)展。因此,探討引發(fā)炎癥失衡的關(guān)鍵細(xì)胞因子會(huì)給哮喘的防治帶來(lái)新的曙光。有研究通過(guò)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),能使哮喘的氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應(yīng)件等病理生理變化趨于正常化。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)VEGF在職業(yè)相關(guān)因素甲苯二異氰酸鹽(TDI)誘導(dǎo)AEC通透性的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。上述均提示VEGF可能成為哮喘

4、防治的重要靶點(diǎn)。
　　 哮喘的觸發(fā)因素很多,塵螨是自然界導(dǎo)致哮喘發(fā)生的最常見(jiàn)的致敏原,而且有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)利用塵螨刺激能夠成功建立哮喘動(dòng)物模型。但是塵螨導(dǎo)致哮喘的發(fā)生、發(fā)展的確切機(jī)制目前仍不明確,需要深入探討。
　　 研究已經(jīng)證實(shí)哮喘存在氧化還原的失衡,氧化應(yīng)激與哮喘發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),涉及哮喘自然病史、氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性但機(jī)制仍不清楚。因此,探討哮喘中的氧化應(yīng)激機(jī)制有可能為哮喘的防治提供新的靶點(diǎn)。
　　 鑒

5、于塵螨及氧化應(yīng)激在哮喘發(fā)病中的重要的作用,本實(shí)驗(yàn)將在前期研究基礎(chǔ)上選擇VEGF為主要檢測(cè)指標(biāo),利用體外AEC研究模型,探討塵螨、過(guò)氧化氫刺激下HBE表達(dá)VEGF的影響及機(jī)制,試圖為哮喘的發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 課題第一部分:標(biāo)準(zhǔn)化屋塵螨制劑(安脫達(dá)(R)SQ)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞(16-HBE)表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)(VEGF)的影響及可能機(jī)制
　　 方法:
　　 1、購(gòu)買標(biāo)準(zhǔn)化塵螨制劑(安脫達(dá)(R)

6、SQ)。
　　 2、四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)不同標(biāo)準(zhǔn)化塵螨制劑(以下簡(jiǎn)稱塵螨)濃度對(duì)16-HBE活力的影響,分組情況:正常對(duì)照組,塵螨100U/L組,塵螨200U/L組,塵螨400U/L組,塵螨600U/L組,塵螨800U/L組,塵螨1000U/L組,塵螨2000U/L組。
　　 3、觀察不同濃度塵螨對(duì)16-HBE VEGF基因表達(dá)的影響,分組情況:正常對(duì)照組,塵螨200U/L組,塵螨400U/L組,塵螨600U/L組

7、,塵螨800U/L組,塵螨1000U/L組。按上述刺激24h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,并提取總RNA,應(yīng)用Real time-PCR檢測(cè)16-HBE的VEGF基因表達(dá)情況。
　　 4、選取對(duì)VEGF升高最明顯的塵螨濃度400U/L,預(yù)先加入PI3K特異阻斷劑LY294002處理45min,濃度為10μmol/L,并設(shè)單獨(dú)加入LY294002(10μmol/L)組,上述刺激24h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,并提取總RNA,應(yīng)用Real tim

8、e-PCR檢測(cè)16-HBE的VEGF基因表達(dá)情況。
　　 5、應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)上述細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF蛋白表達(dá)情況。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,方差齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-way ANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時(shí)總體均數(shù)的比較采用Welkch法,各組間多重比較采用Dunnett’s T3法檢驗(yàn),以

9、P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:標(biāo)準(zhǔn)化塵螨制劑在不影響細(xì)胞活力的情況下,在一定濃度范圍內(nèi)能夠在基因和蛋白水平上調(diào)16-HBE VEGF(165)的表達(dá),以400U/L濃度時(shí)最顯著,且能夠被PI3K通路特異阻斷劑LY294002所抑制。提示標(biāo)準(zhǔn)化塵螨制劑可PI3K通路依賴地上調(diào)16-HBE VEGF基因和蛋白的表達(dá)。
　　 第二部分:過(guò)氧化氫對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)VEGF的影響及可能機(jī)制
　　 方法:

10、r>　　 1、觀察不同濃度的過(guò)氧化氫(H2O2)對(duì)正常人支氣管上皮細(xì)胞16-HBE細(xì)胞活力影響:分組如下:正常對(duì)照組、H2O2(10μmol/L)組、H2O2(50μmol/L)組、H2O2(100μmol/L)組、H2OO2(200μmol/L)組、H2O2(300μmol/L)組、H2O2(400μmol/L)組、H2O2(500μmol/L),按上述分組刺激16-HBE 12小時(shí)后,用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力。
　　 2

11、、觀察不同濃度H2O2及PI3K通路特異性阻斷劑LY294002對(duì)16-HBE表達(dá)VEGF基因的影響:實(shí)驗(yàn)分成7組:正常對(duì)照組、H2O2(50μmol/L)組、H2O2(100μmol/L)組、H2O2(150μmol/L)組、H2O2(200μmol/L)組、H2O2(100μmol/L)+LY294002(10μmol/L)組、LY294002(10μmol/L)組。按上述分組刺激16-HBE 12小時(shí)后,收集細(xì)胞上清并提取細(xì)胞總R

12、NA,應(yīng)用Real time-PCR檢測(cè)16-HBE的VEGF基因表達(dá)情況。
　　 3、觀察不同濃度的N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)正常人支氣管上皮細(xì)胞16-HBE細(xì)胞活力影響:分組如下:正常對(duì)照組、NAC(10mmol/L)組、NAC(20mmol/L)組、NAC(50mmol/L)組,按上述分組刺激16-HBE12小時(shí)后,用四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞活力。
　　 4、觀察不同濃度NAC作用下H2O2(100umol

13、/L)對(duì)16-HBE表達(dá)VEGF基因的影響:實(shí)驗(yàn)分為8組:正常對(duì)照組、NAC(10mmol/L)組、NAC(20mmol/L)組、NAC(50mmol/L)組、H2O2(100μmol/L)組、H2O2(100μmol/L)+NAC(10mmol/L)、H2O2(100μmol/L)+NAC(20mmol/L)組、H2O2(100μmol/L)+NAC(50mmol/L)組,按上述分組刺激16-HBE12小時(shí)后,收集細(xì)胞上清并提取細(xì)胞總

14、RNA,應(yīng)用Real time-PCR檢測(cè)16-HBE的VEGF基因表達(dá)情況。
　　 5、應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)上述細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF蛋白表達(dá)情況。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,方差齊時(shí),總體均數(shù)的比較采用單向方差分析(one-wayANOVA),各組間多重比較采用LSD法,方差不齊時(shí)總體均數(shù)的比較采用Welkch法,各組間多重比較采

15、用Dunnett’s T3法檢驗(yàn)。以P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 過(guò)氧化氫(H2O2)在不影響細(xì)胞活力的情況下,在一定濃度范圍內(nèi)能在基因和蛋白水平上調(diào)16-HBE VEGF(165)的表達(dá),以H2O2(100μmol/L)時(shí)最顯著,且能夠被PI3K通路特異阻斷劑LY294002所抑制,過(guò)氧化氫可經(jīng)由PI3K通路上調(diào)16-HBE VEGF的表達(dá)。NAC在不影響細(xì)胞活力的情況下能夠逆轉(zhuǎn)由過(guò)氧化氫導(dǎo)致的16